一种己糖激酶冻干粉的制备方法技术

本发明专利技术属于酶制剂的制备，特别是指一种己糖激酶冻干粉的制备方法。按照公开号为CN106479992A中的方法制备己糖激酶纯酶液；在己糖激酶纯酶液中加入蔗糖、乳糖、山梨醇作为冻干保护剂，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥得到白色己糖激酶冻干粉。本发明专利技术解决了目前己糖激酶直接进行冷冻干燥导致的失活率高的问题，具有己糖激酶冻干粉酶活保存率高、相对液态己糖激酶酶性质较稳定、符合国标中对于试剂盒的使用要求且更利于保存等优点。

A preparation method of hexose kinase freeze-dried powder

The invention belongs to the preparation of enzyme preparation, in particular to a preparation method of hexokinase freeze dried powder. The pure enzyme solution of hexokinase was prepared according to the method in CN106479992A, and sucrose, lactose and sorbitol were added to the pure enzyme solution of hexokinase as a freeze-drying agent. The protectant was fully dissolved and distributed evenly in the enzyme solution. The white hexokinase freeze-dried powder was prepared by freezing and drying in a vacuum freeze drying agent. The present invention solves the problem of high deactivation rate caused by direct freeze drying of hexose kinase, high survival rate of hexokinase freeze-dried powder enzyme, relatively stable property of liquid hexokinase enzyme, suitable for the use of kits in national standard and more favorable for preservation.

【技术实现步骤摘要】
一种己糖激酶冻干粉的制备方法
本专利技术属于酶制剂的制备，特别是指一种己糖激酶冻干粉的制备方法。
技术介绍
在糖尿病的诊断、疗效观察和一般的临床诊断中血清葡萄糖(GLU)检测的应用非常广泛。己糖激酶法因其干扰因素少，作用于α-D-葡萄糖能力很强，Km值很小，对底物亲和力很强，配成成品试剂盒测定时间短，尤其适用于全自动分析仪，特别适用于急诊检验使用，被认定是测定血清葡萄糖的参考方法。己糖激酶在生产和使用的过程中，需要长期保存，液体状态下4℃保存时间短，-20℃冻存会因反复冻融导致聚集、修饰、降解、污染等不良后果。己糖激酶冷冻干燥是将样品在低温下冷冻，然后在真空条件下，利用升华去除水分从而使样品处于干燥状态的单元操作。加入的冻干保护剂能够取代水与蛋白结合，使蛋白的结构免遭破坏，保证了己糖激酶的稳定性。己糖激酶冻干粉在生物医药领域具有非常广泛的应用前景，但目前国内己糖激酶的真空冷冻干燥技术尚不够完善，己糖激酶直接进行冷冻干燥，失活率达99％以上，因此选择合适的己糖激酶冻干保护剂至关重要。己糖激酶作为诊断试剂盒配制中的关键酶，其酶性质决定了试剂盒品质的好坏，特别是己糖激酶的稳定性，直接影响诊断试剂盒的稳定性。在临床化学体外检测试剂(盒)的检测标准中(GB/T26124-2011)规定，稳定性是检验诊断试剂盒合格与否的重要指标，因此，制备稳定性高的己糖激酶是配制稳定性良好的诊断试剂盒的关键。申请人检索的国内外专利文献情况如下：申请人未曾查询到关于己糖激酶冻干粉的制备方法的相关文献报道。公开号为CN106932353A的专利文献中公开了一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，是通过R1和R2两种试剂来完成诊断试剂盒的配制，其中己糖激酶是试剂R1的组成部分，但该文献中未涉及己糖激酶冻干粉的制备。公开号为CN106868096A的专利文献中公开了一种稳定性强且成本低的己糖激酶法葡萄糖检测试剂，以己糖激酶为主要原料配制了一种稳定的低成本的液态己糖激酶法检测血清葡萄糖检测试剂，但该文献中也未涉及己糖激酶冻干粉的制备。国内目前对己糖激酶的研究相对较少，申请人在公开号为CN106479992A的专利文献中公开了诊断用己糖激酶的制备方法，是利用微生物菌株生产制备出了液态己糖激酶，但未涉及己糖激酶干粉的制备。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种己糖激酶冻干粉的制备方法，所制备的己糖激酶冻干粉失活率低且性质稳定，利于保存。本专利技术的整体技术构思是：一种己糖激酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为200-300U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3％-5％(m/v)蔗糖、1％-2％(m/v)乳糖、6％-8％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4-5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；C、在预冻温度为-20℃的条件下预冻12-14h，预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥16-20h，得到白色己糖激酶冻干粉，在-20℃保存。目前国内对于己糖激酶酶活的检测方法在国标及行业技术规范中未见说明，为验证本专利技术所制备的己糖激酶冻干粉的酶活，申请人参照Sigma己糖激酶的测定方法进行酶活的检测，具体步骤如下：测定方法：分别添加1ml0.05mol/L的TEA-HCL，1ml0.555mol/L的D-葡萄糖，0.1ml0.019mol/L的ATP，0.2ml0.1mol/L的MgCl2,0.2ml0.014mol/L的NADP+，0.02ml125U/mL的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶到试验管和空白管。混匀后于25℃水浴1min，于340nm处读取吸光值A1。然后试验管加入0.05mL待测酶液，空白管加入0.05mLddH2O，于25℃继续反应5min，后读取吸光值A2。酶活计算公式(U/mL)＝(ΔA试验管-ΔA空白管)×2.57×Df÷6.22÷0.05公式中2.57：反应液总体积；Df：稀释倍数；6.22：β-NADPH在340nm处的吸光系数；0.05：比色皿体积。本专利技术所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：本专利技术通对冻干保护剂进行筛选、优化组合，最终得到了一种酵母产己糖激酶冻干粉，采用本专利技术的方法所制备的己糖激酶冻干粉酶活保存率最高可达85％，所制备的己糖激酶冻干粉相对液态己糖激酶酶性质较稳定，符合国标中对于试剂盒的使用要求，更利于保存。有效解决了己糖激酶在储藏和运输过程中酶活损失严重的问题。为己糖激酶应用于生物医药领域提供了极大便利条件。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步描述，但不作为对本专利技术的限定。本专利技术的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本专利技术的保护范畴。实施例1一种己糖激酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为200U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3％(m/v)蔗糖、1％(m/v)乳糖、6％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4-5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；C、在预冻温度为-20℃的条件下预冻12-14h，预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥16-20h，得到白色己糖激酶冻干粉，在-20℃保存。实施例2本实施例与实施例1的区别在于：一种己糖激酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为300U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入5％(m/v)蔗糖、2％(m/v)乳糖、8％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4-5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；其余内容同实施例1。实施例3本实施例与实施例1的区别在于：一种己糖激酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为250U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入4％(m/v)蔗糖、1.5％(m/v)乳糖、7％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4-5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀。其余内容同实施例1。实施例4本实施例与实施例1的区别在于：一种己糖激酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为220U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3.5％(m/v)蔗糖、1.2％(m/v)乳糖、6.5％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4-5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀。其余内容同实施例1。实施例5本实施例与实施例1的区别在于：一种己糖激酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为280U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3.8％(m/v)蔗糖、1.8％(m/v)乳糖、6.8％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4-5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀。其余内容同实施例1。申请人采用Sigma己糖激酶的测定方法对实施例1-5中制备的己糖激酶冻干粉进行酶活的检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种己糖激酶冻干粉的制备方法，其特征在于由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为200‑300U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3％‑5％(m/v)蔗糖、1％‑2％(m/v)乳糖、6％‑8％(m/v)山梨醇作为冻干保护剂，置于4℃保存4‑5h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；C、在预冻温度为‑20℃的条件下预冻12‑14h，预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥16‑20h，得到白色己糖激酶冻干粉，在‑20℃保存。

【技术特征摘要】
1.一种己糖激酶冻干粉的制备方法，其特征在于由如下工艺步骤组成：A、按照公开号为CN106479992A中的方法制备酶活为200-300U/ml的己糖激酶纯酶液；B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3％-5％(m/v)蔗糖、1％-2％(m/v...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春卯，曹倩荣，郑翔，秦艳梅，马清河，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13