用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对。所述引物对包括SHOX2正向引物、反向引物及检测探针，β‑Actin正向引物、反向引物及检测探针。本发明专利技术涉及一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的试剂盒。所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液，其包括正向引物、反向引物、检测探针，10×PCR buffer，dNTP、无核酸酶水及Ex Taq酶。本发明专利技术还涉及一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有检测结果准确、检测通量高、特异性好、灵敏性好、检测时间快速、使用方便并能有效满足临床要求的优点。

Primer pairs, kit and method for detection of lung cancer related gene SHOX2 methylation

The invention relates to a primer pair for detection of lung cancer related gene SHOX2 methylation. The primer pairs include SHOX2 forward primers, reverse primers and detection probes, beta Actin forward primers, reverse primers and detection probes. The invention relates to a kit for detection of lung cancer related gene SHOX2 methylation. The kit includes the PCR reaction liquid containing the primers and probes, including positive primers, reverse primers, detection probes, 10 x PCR buffer, dNTP, no nuclease water and Ex Taq enzyme. The invention also relates to a method for detecting methylation of lung cancer related genes SHOX2. The kit provided by the invention has the advantages of accurate detection results, high detection flux, good specificity, good sensitivity, fast detection time, convenient use and effective meeting the clinical requirements.

【技术实现步骤摘要】
用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，特别的，涉及一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法。
技术介绍
肺癌是中国发病率首位的癌症，虽然组织学活检和细胞学检测可以确诊肺癌，但其检出时病情多已处于较晚期，且检出率并不理想。人矮小同源盒基因SHOX2的甲基化与肺癌密切相关，SHOX2基因甲基化检测为解决这个问题提供了一个较为有效的选项，多项临床试验证明其与组织学或细胞学检测联合使用提高了确诊率，是辅助确诊肺癌的有效工具。SHOX2基因是与肺癌密切相关的肿瘤抑制基因，其启动子部位CpG岛甲基化是所述基因失活的主要机制之一。本专利技术通过分别检测SHOX2基因启动子部位CpG岛甲基化，可以在分子水平上较完善的评估患者的肺癌变和转归的实际情况，有效的指导治疗。从而避免了现今肺癌治疗的误诊和过治疗，以及漏诊。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共价结合到DNA分子的胞嘧啶(C)碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，而并不改变DNA的序列。众多研究表明，SHOX2基因启动子甲基化与肺癌的发生和发展密切相关，它是肺癌特异的分子标记。因此，检测肺癌SHOX29基因启动子的甲基化状态，对肺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。目前，组织活检对于患者而言具有较大的创伤，也会因为肿瘤具有异质性，产生假阳性结果。痰液样本相对组织样本易获得，且对患者无创。此外，传统的甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用。本专利技术采用荧光实时PCR技术，对病人血浆游离核酸SHOX2基因甲基化进行检测，通过对样本进行重亚硫酸盐处理后，通过特异性引物和探针对核酸进行扩增，以达到快速检测SHOX2基因甲基化的目的，最终间接为人肺癌早期诊断提供有效信息，为人肺癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。
技术实现思路
为了解决上述传统甲基化检测方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的技术问题，本专利技术提供一种操作简单、准确性高及敏感性高且基于荧光PCR技术的用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对、试剂盒及其方法。本专利技术提供了一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对，包括针对SHOX2基因的启动子区和β-Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：SHOX2正向引物：5'-TTTTGGATAGTTAGGTAATTTTYGTT-3'(SEQIDNO.1)，SHOX2反向引物：5'-ACGAACCCTTTAAACAACCAACATAA-3'(SEQIDNO.2)，SHOX2第一检测探针：5'FAM-AAACGCCTATACTCGTACG-3'MGB(SEQIDNO.3)；SHOX2第二检测探针：5'VIC-CGATCGAACAAACG-3'MGB(SEQIDNO.4)；β-Actin正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'(SEQIDNO.5)，β-Actin反向引物：5'-CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA-3'(SEQIDNO.6)，β-Actin检测探针：5'ROX-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB(SEQIDNO.7)。Y为兼并碱基，即Y＝C/T。本专利技术还提供了一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的试剂盒，包括含有如上述引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括：SHOX2正向引物、SHOX2反向引物、SHOX2第一检测探针、SHOX2第二检测探针，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物、β-Actin检测探针，10×PCRbuffer，dNTP及无核酸酶水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括ExTaq酶。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCRbuffer，0.4μMSHOX2正向引物、0.4μMSHOX2反向引物、0.4μMSHOX2第一检测探针、0.4μMSHOX2第二检测探针，0.4μMβ-Actin正向引物、0.4μMβ-Actin反向引物、0.4μMβ-Actin检测探针，0.25mMdNTP。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品及阴性对照品，所述阳性对照品为SHOX2甲基化标准品DNA，所述阴性对照品为非甲基化标准品DNA。其中所述SHOX2甲基化标准品DNA为正常人外周血基因组DNA经SssⅠ甲基化酶处理，可使基因组所有CG序列中的C在C5位置上甲基化；所述非甲基化标准品DNA为正常人外周血基因组DNA。本专利技术还提供了一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的方法，包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提的DNA，对其进行转化处理，转化后的DNA作为PCR的模板；步骤二：提供上述用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的试剂盒，对所述模板进行PCR扩增；步骤三：根据SHOX2与β-Actin基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待检测样本的甲基化率，即待检测样本中SHOX2/β-Actin的比值除以阳性对照品中SHOX2/β-Actin的比值。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述步骤一中转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述步骤二中PCR扩增反应程序为：95℃变性5min；45cycles，95℃15sec，60℃30sec。相较于现有技术，本专利技术提供的用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法的有益效果在于：一、通过设计特异性高的引物及探针，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再设计出科学合理的PCR反应体系，使得本专利技术具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，实现对肺癌SHOX2基因的甲基化程度快速及准确测量，以便对肺癌间接进行及时、有效的诊断和治疗，降低医疗成本，节约社会资源。二、使用基因β-actin作为内参基因对样本的质量进行控制，考虑到管家基因可能甲基化的情况，在设计内参引物探针时选择没有CpG岛的位置，针对其硫化后的序列进行设计，保证管家基因对样本的质控。三、通过对样本进行重亚硫酸盐处理后，特异性引物和探针对核酸进行扩增，测定SHOX2基因的启动子区中与肺癌肿瘤最相关的CpG位点，判定目标基因的甲基化，并根据同步处理的临床确定的阳性样本和阴性样本制备的标准曲线，初步判断样本的甲基化程度，评价肺癌患者在不同时期SHOX2基因甲基化程度；并同时测定样本中的内参基因β-actin，既可对样本进行质量控制，又可在一定程度上对样本的甲基化水平进行评价。此方法可达到快速检测SHOX2基因甲基化的目的，最终间接为人肺癌早期诊断提供有效信息，为人肺癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。附图说明图1为SHOX2甲基化阳性样本浓度梯度稀释的扩增曲线图；图2为未亚硫酸盐处理的gDNA扩增曲线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对，其特征在于，包括针对SHOX2基因的启动子区和β‑Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：SHOX2正向引物：5'‑TTTTGGATAGTTAGGTAATTTTYGTT‑3'，SHOX2反向引物：5'‑ACGAACCCTTTAAACAACCAACATAA‑3'，SHOX2第一检测探针：5'FAM‑AAACGCCTATACTCGTACG‑3'MGB；SHOX2第二检测探针：5'VIC‑CGATCGAACAAACG‑3'MGB；β‑Actin正向引物：5'‑GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT‑3'，β‑Actin反向引物：5'‑CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA‑3'，β‑Actin检测探针：5'ROX‑CCCATTAACTAAACACAACCT‑3'MGB。

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的引物对，其特征在于，包括针对SHOX2基因的启动子区和β-Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：SHOX2正向引物：5'-TTTTGGATAGTTAGGTAATTTTYGTT-3'，SHOX2反向引物：5'-ACGAACCCTTTAAACAACCAACATAA-3'，SHOX2第一检测探针：5'FAM-AAACGCCTATACTCGTACG-3'MGB；SHOX2第二检测探针：5'VIC-CGATCGAACAAACG-3'MGB；β-Actin正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'，β-Actin反向引物：5'-CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA-3'，β-Actin检测探针：5'ROX-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB。2.一种用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括：SHOX2正向引物、SHOX2反向引物、SHOX2第一检测探针、SHOX2第二检测探针，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物、β-Actin检测探针，10×PCRbuffer，dNTP及无核酸酶水。3.根据权利要求2所述的用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ExTaq酶。4.根据权利要求2所述的用于肺癌相关基因SHOX2甲基化检...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩林志，肖芳，
申请(专利权)人：韩林志，
类型：发明
国别省市：湖南,43