一种N糖基化肽段富集试剂盒及其富集方法技术

本发明专利技术提供一种N糖基化肽段富集试剂盒及其富集方法，属于蛋白质或者多肽富集技术领域，通过三种凝集素混合物高度富集样品中糖基化修饰肽段、使用

【技术实现步骤摘要】
一种N糖基化肽段富集试剂盒及其富集方法
本专利技术属于蛋白质或者多肽富集
，尤其涉及一种N糖基化肽段富集试剂盒，还涉及一种N糖基化肽段富集方法。
技术介绍
蛋白质糖基化是一种重要的基因翻译后修饰，约有一半以上的蛋白质发生了糖基化。越来越多的数据表明，糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响。例如糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，免疫系统中几乎所有的关键分子都是糖蛋白。目前蛋白质组学水平的蛋白质糖基化研究面临2个突出问题：一个是糖蛋白分离富集/非糖蛋白去除问题，另一个是二级质谱的裂解效率问题。因为糖蛋白常是相对量比较少且糖基化具有不均一性，传统的分离方法一般难以将糖蛋白与大量的非糖蛋白分离开来；而且鉴定糖基化位点需要质量比较高的二级图谱，目前广泛应用的CID、PSD等裂解技术经常不能满足要求。实际上，这也是蛋白质组学中其他翻译后修饰研究如磷酸化、泛素化等共同面临的问题。
技术实现思路
基于现有技术存在上述问题，本专利技术提供一种N糖基化肽段富集试剂盒及其富集方法，通过三种凝集素混合物高度富集样品中糖基化修饰肽段、使用18O特异标记糖基化肽段，克服了非糖基化肽段去除问题和二级质谱的裂解效率问题，兼具了有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点。本专利技术通过以下技术方案达到目的：一种N糖基化肽段富集试剂盒，其包括凝集素混合液CRW、30KDa超滤管、1xBB试剂、碳酸氢铵溶液、肽N-糖苷酶F溶液；所述的凝集素混合液CRW由刀豆素、麦胚素和蓖麻凝集素混合制成；所述的碳酸氢铵溶液的溶剂是同位素18O标记的水；所述的1xBB的制成方法如下：称取0.040gMnCl2·4H2O、0.022gCaCl2、5.8gNaCl和0.84gTris，加水溶解，再使用HCl调pH至7.6，加水定容至200mL。优选地，所述的凝集素混合液CRW中各凝集素的混合比例是15-25％刀豆素、25-35％麦胚素和45-55％蓖麻凝集素；所述的碳酸氢铵溶液的浓度是20-30mM。优选地，所述的凝集素混合液CRW中各凝集素的混合比例是20％刀豆素、30％麦胚素和50％蓖麻凝集素；所述的碳酸氢铵溶液的浓度是25mM。一种使用上述试剂盒的N糖基化肽段富集方法，其包括以下步骤：步骤S10，取酶解后肽段于试管中按每0.2-1mg加入50μL的用量加入凝集素CWR，重悬肽段，混匀，室温孵育45-75分钟，转入超滤管，离心，弃滤液，固体物备用；步骤S20，向步骤S10获得的固体物中加入1xBB试剂，浸没固体物，混匀重悬，离心，弃滤液，并重复本步骤若干次，得固体物备用；步骤S30，向步骤S20获得的固体物加入碳酸氢铵溶液重悬，重悬固体物后离心，重复加入碳酸氢铵溶液并离心，取离心后固体物置于新的超滤管中，加入碳酸氢铵溶液和N-糖酰胺酶F溶液，室温摇晃混匀，孵育2.5-3.5小时，离心，收集滤液；步骤S40，向步骤S30中的新超滤管中加入碳酸氢铵溶液，离心，收集滤液，合并步骤S30和S40的滤液后即为富集后的肽段滤液。优选地，上述N糖基化肽段富集方法，其包括以下详细步骤：步骤S10，取0.2-1mg酶解后肽段于试管中加入50μL凝集素CWR，重悬肽段，混匀，室温孵育60分钟，转入30KDa超滤管，离心，弃滤液，固体物备用；步骤S20，向步骤S10获得的固体物中加入200μL1xBB试剂，浸没固体物，混匀重悬，离心，弃滤液，并重复本步骤若干次，得固体物备用；步骤S30，向步骤S20获得的固体物加入50μL碳酸氢铵溶液重悬，重悬固体物后离心，重复加入碳酸氢铵溶液并离心，取离心后固体物置于新的30KDa超滤管中，加入40μL碳酸氢铵溶液和1μLN-糖酰胺酶F溶液，使用恒温室温600rpm摇晃1分钟，摇晃混匀后孵育3小时，离心，收集滤液；步骤S40，向步骤S30中的新超滤管中加入40μL碳酸氢铵溶液，离心，收集滤液，合并步骤S30和S40的滤液后即为富集后的肽段滤液。其中，所述的离心的离心力为13000-15000g，离心温度为常温，离心时间是8-12min。其中，所述的离心的离心力为14000g，离心温度为常温，离心时间是10min。其中，所述的步骤S20的重复次数为2-6次。其中，所述的步骤S30的孵育温度35-38℃。其中，所述的步骤S30的孵育温度37℃。本专利技术具有的有益效果：通过三种凝集素混合物结合N糖基化肽段寡糖链，可高度和广谱性地富集糖基化肽段并除去非糖基化肽段，提高糖基化肽段在样品中的含量，从而提高了检测下限，提高了检测灵敏度；通过再18O水中酶解糖链，使得糖基化肽段得到特异性的18O标记，使其和非糖基化肽段在分子量水平上产生约3Da的差异，且易于被现代质谱所检测，提高了检测特异性；实验周期短，一般1天即可完成从酶解到富集标记脱糖等全部实验步骤，同时实验过程安全，试剂盒所含试剂均为蛋白质和一般无机盐水溶液，无可挥发性、有毒、有害物质。附图说明图1，实施例二中经过富集的肽段滤液的色谱分析结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的描述。实施例一：N糖基化肽段富集试剂盒。一种N糖基化肽段富集试剂盒，其包括凝集素混合液CRW、30KDa超滤管、1xBB试剂、碳酸氢铵溶液、肽N-糖苷酶F溶液；所述的凝集素混合液CRW由刀豆素、麦胚素和蓖麻凝集素混合制成；所述的碳酸氢铵溶液的溶剂是同位素18O标记的水；所述的1xBB的制成方法如下：称取0.040gMnCl2·4H2O、0.022gCaCl2、5.8gNaCl和0.84gTris，加水溶解，再使用HCl调pH至7.6，加水定容至200mL。所述的凝集素混合液CRW中各凝集素的混合比例是20％刀豆素、30％麦胚素和50％蓖麻凝集素；所述的碳酸氢铵溶液的浓度是25mM。实施例二：一种N糖基化肽段富集方法。一种使用上述试剂盒的N糖基化肽段富集方法，其包括以下步骤：步骤S10，取0.5mg酶解后肽段于试管中加入50μL凝集素CWR，重悬肽段，混匀，室温孵育60分钟，转入30KDa超滤管，使用离心力为14000g、常温的条件离心10分钟，弃滤液，固体物备用；步骤S20，向步骤S10获得的固体物中加入200μL1xBB试剂，浸没固体物，混匀重悬，使用离心力为14000g、常温的条件离心10分钟，弃滤液，并重复本步骤4次，得固体物备用；步骤S30，向步骤S20获得的固体物加入50μL碳酸氢铵溶液重悬，重悬固体物后使用离心力为14000g、常温的条件离心10分钟，重复加入碳酸氢铵溶液并离心，取离心后固体物置于新的30KDa超滤管中，加入40μL碳酸氢铵溶液和1μLN-糖酰胺酶F溶液，然后放入精巧型恒温混匀器中，室温600rpm摇晃1分钟，摇晃混匀后孵育3小时，再使用离心力为14000g、常温的条件离心10分钟，收集滤液；步骤S40，向步骤S30中的新超滤管中加入40μL碳酸氢铵溶液，使用离心力为14000g、常温的条件离心10分钟，收集滤液，合并步骤S30和S40的滤液后即为富集后的肽段滤液。对上述肽段滤液进行分析得到图1中的色谱图谱。从图谱结果中可以看出通过本专利技术提供的试剂盒和富集方法得到的肽段滤液中的N糖基化肽段富集效果好，检测灵敏度较高，使质谱和色谱分析数据准确更加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种N糖基化肽段富集试剂盒，其特征在于，其包括凝集素混合液CRW、30KDa超滤管、1xBB、碳酸氢铵溶液、肽N‑糖苷酶F溶液；所述的凝集素混合液CRW由刀豆素、麦胚素和蓖麻凝集素混合制成；所述的碳酸氢铵溶液的溶剂是同位素18O标记的水；所述的1xBB的制成方法如下：称取0.040g MnCl2·4H2O、0.022g CaCl2、5.8g NaCl和0.84g Tris，加水溶解，再使用HCl调pH至7.6，加水定容至200mL。

【技术特征摘要】
1.一种N糖基化肽段富集试剂盒，其特征在于，其包括凝集素混合液CRW、30KDa超滤管、1xBB、碳酸氢铵溶液、肽N-糖苷酶F溶液；所述的凝集素混合液CRW由刀豆素、麦胚素和蓖麻凝集素混合制成；所述的碳酸氢铵溶液的溶剂是同位素18O标记的水；所述的1xBB的制成方法如下：称取0.040gMnCl2·4H2O、0.022gCaCl2、5.8gNaCl和0.84gTris，加水溶解，再使用HCl调pH至7.6，加水定容至200mL。2.根据权利要求1所述的一种N糖基化肽段富集试剂盒，其特征在于，所述的凝集素混合液CRW中各凝集素的混合比例是15-25％刀豆素、25-35％麦胚素和45-55％蓖麻凝集素；所述的碳酸氢铵溶液的浓度是20-30mM。3.根据权利要求1所述的一种N糖基化肽段富集试剂盒，其特征在于，所述的凝集素混合液CRW中各凝集素的混合比例是20％刀豆素、30％麦胚素和50％蓖麻凝集素；所述的碳酸氢铵溶液的浓度是25mM。4.一种使用如权利要求1-3任一所述的试剂盒的N糖基化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤S10，取酶解后肽段于试管中按每0.2-1mg加入50μL的用量加入凝集素CWR，重悬肽段，混匀，室温孵育45-75分钟，转入超滤管，离心，弃滤液，固体物备用；步骤S20，向步骤S10获得的固体物中加入1xBB，浸没固体物，混匀重悬，离心，弃滤液，并重复本步骤若干次，得固体物备用；步骤S30，向步骤S20获得的固体物加入碳酸氢铵溶液重悬，重悬固体物后离心，重复加入碳酸氢铵溶液并离心，取离心后固体物置于新的超滤管中，加入碳酸氢铵溶液和N-糖酰胺酶F溶液，室温摇晃混匀，孵育2.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓斌，陈薇，阮宏强，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31