基于液相芯片法的NRAS突变检测试剂盒和延伸引物制造技术

本发明专利技术公开了一种NRAS基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：针对NRAS基因的2号外显子上的12号密码子、13号密码子，3号外显子上的第61位密码子、4号外显子上的146号密码子中的18个突变基因类型及野生基因型分别设计ASPE延伸引物，有anti‑tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠；用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。本发明专利技术所述NRAS基因突变检测液相芯片可用于检测NRAS基因的18种突变类型，检测位点更加全面，提供的结果更加可靠，为医生提供更加准确的诊断依据。

【技术实现步骤摘要】
基于液相芯片法的NRAS突变检测试剂盒和延伸引物
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种NRAS基因突变检测试剂盒和延伸引物，可利用液相芯片技术检测与癌症相关的NRAS基因突变。
技术介绍
Ras基因是一种原癌基因，在细胞的讯息传递路径上，主要为活化控制基因转录的激酶，调节细胞的增殖与分化，是EGFR信号转导通路中一个重要的下游调控基因。在正常细胞中，RAS以非活化状态(GDP结合型)存在，当受到外源信号刺激，RAS发生磷酸化，构象改变而成为活化的GTP结合型，活化的GTP-RAS激活下游RAF信号转导蛋白，直到被降解。RAS基因致瘤性点突变会降低RAS蛋白水解GTP为GDP的能力，导致RAS蛋白与GTP持续性结合，引起下游通路持续性激活，使细胞产生不依赖于生长因子的恶性增殖，导致癌症的发生。神经细胞瘤鼠肉瘤癌基因(Neuroblastomarasviraloncogenehomolog，NRAS)是Ras基因家族成员之一。NRAS基因的突变主要位于第2、3、4外显子上，导致多种恶性肿瘤，在结直肠癌(colorectalcancer,CRC)患者中的突变率为1-6％，在恶性黑素瘤(malignantmelanoma)中的突变概率是20％，是人体肿瘤中常见的致癌基因。临床研究发现NRAS突变的结直肠癌患者在对以西妥昔单抗为主的EGFR单抗药物敏感性显著降低,故NRAS基因突变是抗表皮生长因子受体单抗治疗疗效的独立预测因素。NRAS基因检测已被欧美地区列为大肠癌患者内科治疗前必做的常规检查、美国癌症综合网络(NCCN)的《NCCN结肠癌临床实践指南》与《NCCN直肠癌临床实践指南》列为临床用药必检项目。此外，也有相关的研究表明NRAS突变与肺癌治疗中的TKI耐药有关。也有临床数据表明以Cdk4为药物靶标的抑制剂与MEK抑制剂联合使用可以治疗NRAS突变的黑色素瘤患者。综上，越来越多的证据显示，NRAS突变在人类黑色素瘤、结直肠癌、肺癌等很多肿瘤的发生发展中具有重要意义。因此，在进行相关癌症治疗中，检测患者是否存在相关的NRAS基因功能性突变，可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，显著提高药物疗效，使患者最大程度受益，还可以避免不合理用药造成的病人医疗费用负担及社会医疗资源的浪费。当前，针对于人NRAS基因突变检测的试剂盒基本基于荧光PCR技术平台开发的，最多的突变类型检测也只有9种。虽然荧光PCR与液相芯片技术均具有高通量、高灵敏度等特点,可缩短检测周期、减少成本和提高效率等优点。PCR此前，本专利技术的专利技术人研发过NRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片(ZL2011102697755)，其检测的位点包括NRAS基因2号外显子、3号外显子、4号外显子上面13种基因突变类型。而在实际临床应用中，发现上述检测位点还不能满足单管全面检测分析的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供NRAS基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测NRAS基因的2号外显子、3号外显子、4号外显子上所以与结直肠癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤相关的18种基因突变类型即G34A、G34T、G34C、G35A、G35C、G35T、G37C、G37T、G38A、G38T、G38C、C181A、A182C、A182T、A182G、A183T、G436A、G437T与正常的三种基因型，提供更较全面、精确、便捷的检测方式，克服了当前单管检测单一反应，检测位点单一，灵敏度不高，检测成本高的缺点，为临床治疗提供有力的证据。实现上述目的技术方案如下。一种NRAS基因突变检测液相芯片试剂盒，包括有：(A).针对NRAS基因的2号外显子上的12号密码子、13号密码子，3号外显子上的第61位密码子、4号外显子上的146号密码子中的18个突变基因类型及野生基因型分别设计ASPE延伸引物，每种ASPE延伸引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物序列组成，突变基因类型的所述特异性引物序列选自以下至少一种：针对G34A位点的SEQIDNO.22，针对G34T位点的SEQIDNO.23，针对G34C位点的SEQIDNO.24，针对G35A位点的SEQIDNO.25，针对G35C位点的SEQIDNO.26，针对G35T位点的SEQIDNO.27，针对G37C位点的SEQIDNO.28，针对G37T位点的SEQIDNO.29，针对G38A位点的SEQIDNO.30，针对G38T位点的SEQIDNO.31，针对G38C位点的SEQIDNO.32，针对C181A位点的SEQIDNO.33，针对A182C位点的SEQIDNO.34，针对A182T位点的SEQIDNO.35，针对A182G位点的SEQIDNO.36，针对A183T位点的SEQIDNO.37，针对G436A位点的SEQIDNO.38，针对G437T位点的SEQIDNO.39；野生基因型的ASPE延伸引物选自相应的以下至少一种：针对2号外显子的SEQIDNO.40，针对3号外显子SEQIDNO.41、针对4号外显子SEQIDNO.73；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠，所述anti-tag序列与磁珠连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.42～SEQIDNO.62，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列完全互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。在其中一个实施例中，所述扩增引物为选自以下至少一对：针对2号外显子的SEQIDNO.63和SEQIDNO.64，针对3号外显子SEQIDNO.65和SEQIDNO.66、针对4号外显子SEQIDNO.67和SEQIDNO.68。在其中一个实施例中，包括有权利要求1中所述的18个突变位点的相应的ASPE延伸引物，所述磁珠和所述扩增引物。在其中一个实施例中，所述间隔臂为5－10个T。本专利技术的另一个目的是提供一种用于NRAS基因突变检测的ASPE延伸引物。实现上述目的的技术方案如下。用于NRAS基因突变检测液的ASPE延伸引物，针对NRAS基因的2号外显子上的12号密码子、13号密码子，3号外显子上的第61位密码子、4号外显子上的146号密码子中的18个突变基因类型及野生基因型分别设计ASPE延伸引物，每种ASPE延伸引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物序列组成，突变基因类型的所述特异性引物序列选自以下至少一种：针对G34A位点的SEQIDNO.22，针对G34T位点的SEQIDNO.23，针对G34C位点的SEQIDNO.24，针对G35A位点的SEQIDNO.25，针对G35C位点的SEQIDNO.26，针对G35T位点的SEQIDNO.27，针对G37C位点的SEQIDNO.28，针对G37T位点的SEQIDNO.29，针对G38A位点的SEQIDNO.30，针对G38T位点的SEQIDNO.31，针对G38C位点的SEQIDNO.32，针对C181A位点的SEQIDNO.33，针对A182C位点的SEQIDNO.34，针对A182T位点的SEQIDNO.35，针对A182G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NRAS基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征是，包括有：(A).针对NRAS基因的2号外显子上的12号密码子、13号密码子，3号外显子上的第61位密码子、4号外显子上的146号密码子中的18个突变基因类型及野生基因型分别设计ASPE延伸引物，每种ASPE延伸引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物序列组成，突变基因类型的所述特异性引物序列选自以下至少一种：针对G34A位点的SEQ ID NO.22，针对G34T位点的SEQ ID NO.23，针对G34C位点的SEQ ID NO.24，针对G35A位点的SEQ ID NO.25，针对G35C位点的SEQ ID NO.26，针对G35T位点的SEQ ID NO.27，针对G37C位点的SEQ ID NO.28，针对G37T位点的SEQ ID NO.29，针对G38A位点的SEQ ID NO.30，针对G38T位点的SEQ ID NO.31，针对G38C位点的SEQ ID NO.32，针对C181A位点的SEQ ID NO.33，针对A182C位点的SEQ ID NO.34，针对A182T位点的SEQ ID NO.35，针对A182G位点的SEQ ID NO.36，针对A183T位点的SEQ ID NO.37，针对G436A位点的SEQ ID NO.38，针对G437T位点的SEQ ID NO.39；野生基因型的ASPE延伸引物选自相应的以下至少一种：针对2号外显子的SEQ ID NO.40，针对3号外显子SEQ ID NO.41、针对4号外显子SEQ ID NO.73；(B).有anti‑tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠，所述anti‑tag序列与磁珠连接中间还设有间隔臂序列；所述anti‑tag序列选自SEQ ID NO.42～SEQ ID NO.62，且所述anti‑tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列完全互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。...

【技术特征摘要】
1.一种NRAS基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征是，包括有：(A).针对NRAS基因的2号外显子上的12号密码子、13号密码子，3号外显子上的第61位密码子、4号外显子上的146号密码子中的18个突变基因类型及野生基因型分别设计ASPE延伸引物，每种ASPE延伸引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物序列组成，突变基因类型的所述特异性引物序列选自以下至少一种：针对G34A位点的SEQIDNO.22，针对G34T位点的SEQIDNO.23，针对G34C位点的SEQIDNO.24，针对G35A位点的SEQIDNO.25，针对G35C位点的SEQIDNO.26，针对G35T位点的SEQIDNO.27，针对G37C位点的SEQIDNO.28，针对G37T位点的SEQIDNO.29，针对G38A位点的SEQIDNO.30，针对G38T位点的SEQIDNO.31，针对G38C位点的SEQIDNO.32，针对C181A位点的SEQIDNO.33，针对A182C位点的SEQIDNO.34，针对A182T位点的SEQIDNO.35，针对A182G位点的SEQIDNO.36，针对A183T位点的SEQIDNO.37，针对G436A位点的SEQIDNO.38，针对G437T位点的SEQIDNO.39；野生基因型的ASPE延伸引物选自相应的以下至少一种：针对2号外显子的SEQIDNO.40，针对3号外显子SEQIDNO.41、针对4号外显子SEQIDNO.73；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠，所述anti-tag序列与磁珠连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.42～SEQIDNO.62，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列完全互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。2.根据权利要求1所述的NRAS基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征是，所述扩增引物为选自以下至少一对：针对2号外显子的SEQIDNO.63和SEQIDNO.64，针对3号外显子SEQIDNO.65和SEQIDNO.66、针对4号外显子SEQIDNO.67和SEQIDNO.68。3.根据权利要求1所述的NRAS基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征是，突变基因类型的所述ASPE延伸引物选自以下中的至少一种：针对G34A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.22组成的序列，针对G34T位点的由SEQIDNO.2和SEQIDNO.23组成的序列，针对G34C位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.24组成的序列，针对G35A位点的由SEQIDNO.4和SEQIDNO.25组成的序列，针对G35C位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.26组成的序列，针对G35T位点的由SEQIDNO.6和SEQIDNO.27组成的序列，针对G37C位点的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.28组成的序列，针对G37T位点的由SEQIDNO.8和SEQIDNO.29组成的序列，针对G38A位点的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.30组成的序列，针对G38T位点的由SEQIDNO.10和SEQIDNO.31组成的序列，针对G38C位点的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.32组成的序列，针对C181A位点的由SEQIDNO.12和SEQIDNO.33组成的序列，针对A182C位点的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.34组成的序列，针对A182T位点的由SEQIDNO.14和SEQIDNO.35组成的序列，针对A182G位点的由SEQIDNO.15和SEQIDNO.36组成的序列，针对A183T位点的由SEQIDNO.16和SEQIDNO.37组成的序列，针对G436A位点的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.38组成的序列，针对G437T位点的由SEQIDNO.18和SEQIDNO.39组成的序列；野生基因型所述ASPE延伸引物选自以下中的相应的至少一种：针对2号外显子的由SEQIDNO.19和SEQIDNO.40组成的序列，针对3号...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘真真，许嘉森，吴诗扬，刘志明，刘苏燕，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44