circZFY在肺结核病生物标志物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种circZFY在肺结核病生物标志物中的应用，利用环状RNA表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在肺结核患者血浆中显著高表达的circRNA，即circZFY，其转录区域位于12号染色体，全长1909bp。与健康对照者血浆相比，circZFY在肺结核患者血浆中显著高表达，并在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实肺结核患者血浆circZFY表达水平显著高于健康对照者。肺结核患者血浆circZFY表达水平在抗结核治疗后6月后显著降低。本发明专利技术制备了筛查circZFY的引物，circZFY将为研究肺结核的发病机制提供新的思路，也为肺结核的早期诊断及预后监测提供了新的靶标。

【技术实现步骤摘要】
circZFY在肺结核病生物标志物中的应用
本专利技术属于天然核糖核苷酸的用途，涉及circZFY在肺结核病生物标志物中的应用。
技术介绍
结核病是严重危害人类健康的慢性感染性疾病。WHO的报告显示，2015年约有1040万结核病新发病例，140万人因该病死亡。我国是全球30个结核病流行严重的国家之一，现有结核病患者人数居全球第三位。结核病的预防、诊断和治疗是结核病控制的三个主要环节，考虑到目前全球已有众多的感染者，早期发现和早期诊断结核病病人、及时给予有效治疗，是减少结核病传播机会、控制结核病疫情的关键环节。目前，临床常用的结核病实验室诊断方法主要包括：影像学检查、涂片抗酸染色、结核菌培养、分子生物学及免疫学技术等。典型X线改变对肺结核有诊断价值，但X线胸片诊断肺结核特异性低；在资源匮乏地区，常规抗酸染色涂片对结核病的诊断发挥至关重要的作用，但其敏感度较低，而传统的结核菌培养法则耗时太长，难以满足临床需求。通过检测结核菌及其特异性DNA片段的PCR等分子生物学方法，可用于快速诊断结核菌感染，但存在一定假阳性和假阴性，且检测成本较高。目前发展的以T细胞应答为基础的γ-干扰素释放试验(IGRAs)，相比于结核菌素皮试实验或有更高的敏感性与特异性，但IGRAs涉及操作步骤多、收费昂贵，且无法区分活动性结核病和结核潜伏感染。因此，寻找更为精确的特征性的生物标志物是早期诊断结核病的当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供circZFY在肺结核病生物标志物中的应用，以及检测circZFY的引物。本专利技术利用环状RNA(circRNA)表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在人肺结核病患者血浆中显著高表达的circRNA，即circZFY，其转录区域位于12号染色体，全长1909bp。与健康人群血浆相比，circZFY在人肺结核患者血浆中显著高表达。在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实肺结核患者血浆circZFY表达水平显著高于健康对照者、肺炎患者和肺癌患者。肺结核患者血浆circZFY表达水平在抗结核治疗后6个月后显著降低，与健康对照人群血浆circZFY表达水平差异无统计学意义。这一新型的circZFY将为进一步研究肺结核的发病机制提供新的思路，也为肺结核的早期诊断及预后监测提供了新的靶标。本专利技术提供了鉴别可能患有肺结核病对象的方法及其引物序列结构。所述方法包括检测来自所述对象的样品中的circZFY量，其中较高量的circZFY与所述对象患有肺结核病的可能性增加相关。本专利技术的有益效果有：1)提出了circZFY的用途；2)circZFY是一种新型生物标志物，区别传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。circZFY在肺结核病人的血浆和健康对照者血浆中表达量存在差异，因此，circZFY具有成为肺结核诊断标志物的应用前景。附图说明图1为circRNA芯片检测结果图；图2为使用circZFY筛查引物对肺结核患者和健康对照者血浆样品表达量筛查的结果图；图3为肺结核患者血浆样本circZFY表达量与肺结核病人肺部损伤程度相关性图；图4为抗结核治疗前后患者血浆样本circZFY检测结果图；图5为ROC曲线分析图。具体实施方式环状RNA(circularRNA,circRNA)是一类具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子，在哺乳动物中普遍存在，具有丰度高、结构稳定和组织特异性表达等特征。近年研究表明，circRNA可在转录及转录后水平调控基因表达功能，与多种疾病的发生及发展密切相关。随着circRNA研究的进一步深入，越来越多的证据表明circRNA表达谱会随着疾病进程发生变化。研究已经证实血清/血浆中存在着几百种circRNAs，这些circRNA分子性质稳定，含量丰富且不会降解，易于定量检测，并存在着显著的疾病特异性。血清/血浆circRNA作为疾病诊断和预后分子标志物不仅创伤小，方法便捷，还能改进疾病诊断，预后估计、疗效及复发预测的准确度。目前已有文献报道，circRNA可以作为癌症诊断标志物，但尚未见有关circRNA作为肺结核病诊断标志物的报道。下面结合具体实验步骤对本专利技术进行进一步描述。实施例1：人肺结核患者与健康对照者血浆的circZFY芯片表达分析一、对象和方法1.对象江西省胸科医院结核科收治的肺结核患者3例，其中男2例，女1例。肺结核的诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册(结核病分册)》诊断标准。所有肺结核患者均为初治患者，且痰涂片抗酸均为阳性。健康对照者3例为同期于南昌大学第一附属医院保健科体检者，胸片未见异常，近期无接触结核病史者，IFN-γELISPOT检测结果为阴性，其中男2例，女1例。所有对象均排除合并肿瘤、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制药物的患者；排除HBV、HCV、HIV感染者或(和)AIDS患者；排除孕妇或哺乳期妇女。2.方法(1)样本采集：清晨采集研究对象空腹静脉血，EDTA抗凝，4℃，2000×g离心5min；12000×g离心5min后分离得到血浆，-80℃保存备用。(2)血浆总RNA提取：按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasyMicroKit，货号74004)说明书提取研究对象血浆的总RNA。(3)对样品RNA进行Cy5荧光标记(委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStarHumanCircRNAMicroarrayV1.0Service”进行标记服务)(4)circZFY表达谱分析：根据试剂盒操作步骤，将每个样本的总RNA采用RNaseR处理，去除线性RNA分子，然后采用随机引物扩增、反转录为荧光标记的cRNA，然后在芯片上杂交，洗片后，在扫描仪上扫描。提取circZFY芯片原始数据，用R软件包对数据进行归一化及后续数据处理，寻找2组样本间差异表达的circZFY，通过倍数变化(FoldChange)和P值进行筛选，采用t检验方法，差异circZFY的标准为LPS诱导组与空白对照组表达比值≥1.5倍且P＜0.05。3.结果关于人肺结核患者血浆的circZFY芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的circRNAs。其中circZFY在肺结核患者血浆中表达显著上调，鉴于其可能在人肺结核的血浆中存在特异性高表达，本专利技术通过以下实施例采用大规模样本进行验证。实施例2：实时荧光定量PCR检测circZFY在肺结核患者血浆中的表达一、对象与方法1.对象(1)肺结核组：收集江西省胸科医院结核科收治的初治活动性肺结核患者70例，男40例，女30例，平均年龄(36.7±10.4)岁。肺结核的诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册(结核病分册)》诊断标准，并除外心、肝、肾等脏器并发症。所有肺结核患者均在抗结核治疗前采血。肺结核患者给予规范化治疗：异烟肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺2个月，异烟肼+利福平4个月。20例肺结核患者均在规范化抗结核治疗6个月后采血。(2)健康对照组：收集同期南昌大学第一附属医院进行体检的健康人40例，其中男22例，女18例，平均年龄(38.5±11.2)岁。入组对象胸部影像学检查均正常，无结核病接触史。所有对象均排除合并高血压、糖尿病、慢性本文档来自技高网...

【技术保护点】
circZFY在制备肺结核病生物标志物中的应用，其特征在于，所述circZFY长1909bp，位于人类的第12条染色体上，所述circZFY的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.circZFY在制备肺结核病生物标志物中的应用，其特征在于，所述circZFY长1909bp，位于人类的第12条染色体上，所述circZFY的碱基序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其包括检测被检测对象的样品中的circZFY含量，其中所述circZFY的量与所述被检测对象患有肺结核病的概率成正相关关系。3.如权利要求1或2所述的应用，肺结核病患者在抗结核治疗后circZFY含量降低表示治疗起作用。4.如权利要求2或3所述的应用，其中所述circZFY的含量是从被检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄自坤，李俊明，罗清，姚芳苡，
申请(专利权)人：南昌大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江西,36