用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。所述血清microRNA标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一microRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三microRNA。血清miRNA是新颖的生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确，将大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
本专利技术属于基因工程领域，更具体地，涉及用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。
技术介绍
自然流产是指妊娠不足28周、胎儿体重不足1000g而终止的妊娠。流产发生于妊娠12周前者称早期流产，发生在妊娠12周至28周者称晚期流产。据报道，自然流产的整体发病率为12％～24％，并且发病率有逐年增加的趋势。值得一提的是，复发性流产(recurrentspontaneousabortion，RSA)是自然流产中最为特殊的一种类型，其发病率约为1％～3％，其不良结局较散发性自然流产更为严重，甚至会造成不孕症。对自然流产病因及发病机制的研究是一直国际生殖领域的热点。自然流产其病因复杂，机制尚不明确。目前关于自然流产的机制研究的较多的倾向于免疫因素、遗传因素、血栓性疾病倾向、感染因素、内分泌因素、环境因素等。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类存在于动植物体内、约21-25个核苷酸内源性的单链非编码RNA，目前已从线虫、果绳、家鼠和人中都分离到成百上千种miRNA的初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核内被剪切形成前体miRNA(pre-miRNA)，然后通过转运蛋白由细胞核内转运至细胞质中，进一步形成RNA二聚体。二聚体解链后，一条形成成熟的miRNA，另一条被降解。成熟miRNA与其它蛋白质一起组成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC通过与靶mRNA的3’-UTR完全或不完全互补配对结合，引起靶基因mRNA降解或抑制其蛋白质翻译，从而参与基因的表达调控，影响细胞增殖、凋亡、分化等生命活动过程。在胚胎识别、黏附、植入、胎盘形成和胎儿发育过程中，胚胎与子宫内膜、胎儿与胎盘之间存在着极为复杂的信号传导网络，介导母胎对话。除了甾体激素起主导地位外，其它一些分子如细胞因子、生长因子、粘附分子和趋化因子等都参与这些过程的调节。由子宫内膜形成的蜕膜化组织是母-胎界面间一个非常复杂而又高度协调的微环境，由来自子宫内膜、胚胎(胎儿)及周围组织的多种细胞及其所分泌的细胞因子共同形成了母-胎间信息交流的平台，对子宫内膜的免疫容受性、胚胎滋养细胞的“有控性”侵入、子宫内膜蜕膜化和胎盘的形成进行精确的调控。越来越多的证据表明，miRNA在子宫内膜蜕膜化发生、胎盘形成过程中起重要作用。研究发现血清中存在着很多的miRNA，性质相对稳定、表达量丰富，特异性较高，且易于定量检测。据报道，在肺癌、结肠癌等疾病中已经证实miRNA的表达谱对早期诊断有一定的提示作用，可作为这些疾病的潜在生物标志物。目前还没有将miRNA应用于复发性流产辅助诊断的报道，若能筛选出复发性流产相关的miRNA作为早期诊断的生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对复发性流产的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。所述试剂盒具有测定microRNA标志物在血清中表达的特异性和灵敏度。本专利技术人通过分离和检测复发性流产病例和非医学原因选择流产对照血清中的miRNAs，发现了血清中存在可用于评估复发性流产发生风险的特异性和敏感性的miRNA组合，因而提出了复发性流产患者的血清miRNA标志物组合，以及所述血清miRNA标志物或其引物在制备复发性流产辅助诊断试剂中的应用，研制出便于临床应用的复发性流产诊断试剂盒。具体地，本专利技术的第一方面提供一组用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物，所述血清microRNA标志物包括：与SEQIDNO：1所示核苷酸序列(5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU-3’)具有90％以上同源性的第一microRNA、与SEQIDNO：2所示核苷酸序列(5’-UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG-3’)具有90％以上同源性的第二microRNA和与SEQIDNO：3所示核苷酸序列(5’-CGGCAACAAGAAACUGCCUGAG-3’)具有90％以上同源性的第三microRNA。优选地，所述血清microRNA标志物包括：与SEQIDNO：1所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第一microRNA、与SEQIDNO：2所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第二microRNA和与SEQIDNO：3所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第三microRNA。进一步优选地，所述血清microRNA标志物包括：与SEQIDNO：1所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第一microRNA、与SEQIDNO：2所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第二microRNA和与SEQIDNO：3所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第三microRNA。再优选地，所述血清microRNA标志物包括：具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的第一microRNA(hsa-let-7i-5p)、具有如SEQIDNO：2所示核苷酸序列的第二microRNA(hsa-miR-132-3p)和具有如SEQIDNO：3所示核苷酸序列的第三microRNA(hsa-miR-3656)。本专利技术的第二方面提供用于检测上述的血清microRNA标志物的引物组，所述引物组包括以下引物：用于检测第一microRNA的上游引物和下游引物；用于检测第二microRNA的上游引物和下游引物；用于检测第三microRNA的上游引物和下游引物。本领域技术人员可根据常规手段设计上述引物，优选地，用于检测第一microRNA的上游引物具有SEQIDNO：4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQIDNO：5所示核苷酸序列；用于检测第二microRNA的上游引物具有SEQIDNO：6所示核苷酸序列，下游引物具有SEQIDNO：7所示核苷酸序列；用于检测第三microRNA的上游引物具有SEQIDNO：8所示核苷酸序列，下游引物具有SEQIDNO：9所示核苷酸序列。本专利技术的第三方面提供上述的血清microRNA标志物和/或引物组在制备复发性流产诊断或监测试剂中的应用。本专利技术的第四方面提供一种复发性流产诊断或监测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组。所述试剂盒还可以包括内参，以及相关PCR技术常用的其他试剂。优选地，所述试剂盒还包括：(1)内参U6的正反向引物(SEQIDNO：11、SEQIDNO：12)；和/或(2)DNA聚合酶、通用反向引物(SEQIDNO：10)、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。本专利技术的优越性在于：(1)血清miRNA是新颖的生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确，将大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。该类小分子非编码RNA生物标志物的成功开发，颠覆了以蛋白为主的传统生物标志物的检测方法，将为复发性流产的防治开创全新局面，同时为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)本专利技术提供的血清miRNA标志物可用于复发性流产辅助诊断标志物，通过微创本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物，其特征在于，所述血清microRNA标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一microRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三microRNA。

【技术特征摘要】
1.一组用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物，其特征在于，所述血清microRNA标志物包括：与SEQIDNO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一microRNA、与SEQIDNO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二microRNA和与SEQIDNO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三microRNA。2.根据权利要求1所述的血清microRNA标志物，其中，所述血清microRNA标志物包括：与SEQIDNO：1所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第一microRNA、与SEQIDNO：2所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第二microRNA和与SEQIDNO：3所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第三microRNA。3.根据权利要求1所述的血清microRNA标志物，其中，所述血清microRNA标志物包括：具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的第一microRNA、具有如SEQIDNO：2所示核苷酸序列的第二microRNA和具有如SEQIDNO：3所示核苷酸序列的第三microRNA。4.用于检测权利要求1-3中任意一项所述的血清microRNA标志物...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆春城，于明明，黄晓敏，徐俏俏，黄振遥，姜子燕，夏彦恺，王心如，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32