有条件复制型腺病毒及其构建方法和用途技术

本发明专利技术属生物医学领域，涉及一种可以在肿瘤细胞内选择性复制、而在正常细胞中不复制的、用于肿瘤基因治疗的腺病毒及其构建方法和应用。本发明专利技术所述腺病毒，其中的两个或两个以上的复制必需的早期基因的启动子，分别被肿瘤细胞或肿瘤组织的启动子所取代，病毒能够通过本身的细胞裂解作用，或携带其它治疗基因，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常的组织或细胞基本无害。可单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提高肿瘤治疗效果并减少副作用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物医学领域，涉及一种用于肿瘤基因治疗的腺病毒及其构建方法和应用。具体涉及一种可以在肿瘤细胞内选择性复制、而在正常细胞中不复制的、用于肿瘤基因治疗的腺病毒及其构建方法和应用基因治疗被认为是很有希望的新方法，其最大的优势在于利用正常与肿瘤细胞间在分子水平方面的差异，可以有效地、选择性地攻击肿瘤细胞，大大拓宽了肿瘤的“治疗窗”，在增强治疗效果的同时减少副作用。不过，现有的各种基因治疗方法在临床应用方面仍然面临着许多的困难和障碍。其中最关键的问题是缺乏针对肿瘤细胞的、高效的基因传递载体或系统。腺病毒是一种毒性较小的感冒病毒，对人体危害不大。它的最突出的优点是能够以非常高的效率感染各种人类细胞。因此，重组腺病毒是目前世界各国肿瘤基因治疗研究人员的首选基因导入工具。已有研究，从生物安全性的角度出发，采用复制缺陷型腺病毒作为基因传递的载体。但是，在实际应用中发现复制缺陷型腺病毒传递基因的效率和治疗效果仍然不理想。有文献报道肿瘤局部注射复制缺陷型腺病毒，即使在最优化的状态下也仅仅只有10-15％的病毒能感染肿瘤细胞。因此，应用复制缺陷型腺病毒作肿瘤基因治疗，不仅要求病毒用量很大，而且并非所有的肿瘤细胞均能被同时感染，故难以达到治疗目的。采用具有“旁观者效应”的治疗基因，可以改善或增强治疗效果，但仍然不能完全克服复制缺陷型病毒固有的弱点。随着非复制型腺病毒的大量应用，人们对腺病毒在人体内的分布特点和安全性有了更深入的了解和认识。为了提高治疗基因在肿瘤局部的传递效率和表达水平，研究人员开始使用具有复制能力的腺病毒作为基因传递载体。采用复制型腺病毒必须解决的关键问题是使病毒的复制严格限制在肿瘤细胞内。目前，为了获得肿瘤特异性的复制已有许多不同的方案或策略。典型实例如onyx-015病毒，它能够选择性地在p53基因功能已丧失的肿瘤细胞内复制。由于50％以上的肿瘤均有p53基因失活，理论上讲onyx-015病毒可用于治疗一半以上的肿瘤。不过，目前对onyx015病毒肿瘤特异性问题存在争议，有人观察到onyx-015病毒在p53基因完整的肿瘤细胞内也有复制。尽管如此，onyx-015病毒目前已进入II期临床试验阶段。另一种很有希望的策略是使用肿瘤或组织特异性的启动子控制病毒复制所必须的基因的表达。如CN706病毒，该病毒利用前列腺特异抗原(PSA)基因启动子驱使E1A基因表达，这一病毒已被证实具有前列腺细胞选择毒性。尽管前述的复制型腺病毒有明显的优越性，但它们仍然有一定的缺陷。首先，目前很多组织特异性启动子的活性，在肿瘤和同源组织中相同如PSA。含有这些启动子的复制型病毒也会在正常组织中复制。这就大大局限了这些病毒的应用前景。另外，许多启动子的控制并不是特别的严格，会造成在非靶向的正常细胞里也有一定的病毒复制，从而关窄了治疗窗口。因此，为了加强有条件复制性病毒的疗效并减少其毒性，有必要采取新的策略以进一步改进现有的病毒设计。本专利技术使腺病毒能够选择性地在肿瘤中复制，其携带的各种治疗基因也选择性地在肿瘤中表达，从而达到有效治疗肿瘤而无副作用的目的。本专利技术利用近三十年肿瘤生物学研究进展，模仿各种肿瘤细胞或组织特异性基因的遗传调控方式，重新构建腺病毒。从而达到使腺病毒在肿瘤细胞内能够有效复制而在正常细胞里则不复制的目的。本专利技术所解决的主要问题，是增强有条件复制性病毒在肿瘤细胞中的复制特异性。其核心是通过同时控制两个或两个以上的病毒复制所必需的基因，达到显著增加病毒复制的靶向性。本专利技术根据不同类型肿瘤的遗传特点，在有条件复制性腺病毒里嵌入两个或两个以上肿瘤细胞或状态或组织特异性的启动子来控制那些必需基因，使病毒能够高度特异性地在肿瘤细胞中复制。本专利技术的技术方案通过下述方法和步骤实现，1、通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤特异性启动子，2、构建肿瘤特异性的复制型腺病毒载体，3、包装、扩增、纯化病毒，以及其感染和复制的鉴定，4. 构建和鉴定携带治疗基因的、肿瘤特异性复制型腺病毒载体，5.肿瘤特异性复制型腺病毒载体在活体肿瘤内的复制，6.肿瘤特异性复制型病毒对肿瘤生长的抑制。本专利技术所述的有条件复制性腺病毒，可用于与肿瘤的放射线治疗(radiation therapy)相结合，对肿瘤进行综和治疗。复制性病毒可以在放射治疗以前，放射治疗期间，或放射治疗以后直接注射入肿瘤中。本专利技术所述的有条件复制性腺病毒，可用于与肿瘤的光动力学治疗(photodynamic therapy)结合，对肿瘤进行综和治疗。复制性病毒可以在光动力学治疗以前，光动力学治疗期间，或光动力学治疗以后直接注射入肿瘤中。本专利技术所述的有条件复制性腺病毒，可用于与肿瘤的自杀基因化学治疗(suicide gene chemotherapy)结合，对肿瘤进行综合治疗。其中，自杀基因包括细菌或及酵母的cytosine deaminase基因；疱疹病毒的thymidine kinase基因；以及p450基因。与它们相关的化疗药物分别是5-fluorocytidine(5-FC)，gancyclovir，cyclophosphamide。实施例2构建肿瘤特异性的复制型腺病毒载体将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子通过遗传工程的方法嵌入腺病毒的DNA中，用其控制腺病毒复制必需的早期基因的表达。附图说明图1所述的是重组病毒的构建方法。所述病毒的特点是它们的E1A和E4基因同时被肿瘤组织特异性的启动子所调控。其中控制E1A和E4的启动子，可以是同一个启动子，也可以是不同的启动子。下述组合是本专利技术采用的有条件复制性腺病毒的组合。1)AdHRPE1aTERTE4-dsRed2，TSP1为缺氧诱导性启动子，TSP2为端粒酶启动子； 2)AdAFPE1aTERTE4-dsRed2，TSP1为α-胚胎蛋白启动子，TSP2为端粒酶启动子；3)AdE2F1E1aTERTE4-dsRed2，TSP1为E2F1启动子，TSP2为端粒酶启动子；4)AdMuc1E1aTERTE4-dsRed2，TSP1为MUC1基因启动子，TSP2为端粒酶启动子，5)AdTERTE1a-E4-dsRed2，TSP1为端粒酶启动子，TSP2为端粒酶启动子。上述组合的共同特点是它们的E4基因都在端粒酶启动子的控制之下。因此，它们的复制主要局限在有端粒酶活性的肿瘤细胞内。在此基础上再加上第二个启动子，赋予病毒更高的组织或细胞复制特异性。为了能够准确、客观地观察和分析病毒的存在、感染和复制，本专利技术还可在腺病毒载体中加入荧光蛋白报告基因dsRed2。所述报告基因是来源于珊瑚礁、能自发红色荧光的蛋白基因。其有CMV启动子及SV40多聚腺苷尾。它的存在使所述病毒对细胞的感染及其在细胞内的复制等均可通过荧光显微镜和流式细胞仪进行观察和评估。实施例3包装、扩增、纯化病毒，以及感染和复制的鉴定采用人胚肾293细胞对上述构建病毒进行包装，经过噬菌斑(plaquepurification)筛选后再进行扩增，采用氯化铯密度梯度离心及透析纯化病毒。纯化的病毒滴度均可达3~5×1010pfu/ml。观测病毒在各种肿瘤和正常细胞中的复制情况。其结果如下 1)AdTERTE1a-E4-dsRed2能够感染下述肿瘤细胞，如乳腺癌、前列腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有条件复制型腺病毒，其特征是其中的两个或两个以上的复制必需的早期基因的启动子，分别被肿瘤细胞或肿瘤组织的启动子所取代，它能够特异性地在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞或组织中基本不复制。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李川源，黄倩，
申请(专利权)人：李川源，黄倩，
类型：发明
国别省市：23[中国|黑龙江]