手性茚醇类化合物的酶法制备及其在手性药物拉多替吉合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了多种由野生型光滑假丝酵母酮还原酶(Candida glabrata ketone reductase,CgKR1)基因通过突变得到的具有改良性质的酮还原酶突变体。该酶在E.coli Rosseta(DE3)中表达，并将其与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达制成全细胞催化剂，用于潜手性茚酮的不对称还原及多靶点治疗轻度认知功能障碍药物(R)‑拉多替吉的手性中间体的制备应用。

【技术实现步骤摘要】
手性茚醇类化合物的酶法制备及其在手性药物拉多替吉合成中的应用
本专利技术涉及化学物质和药物制备领域，涉及手性茚醇类化合物的酶法制备及其在手性药物拉多替吉合成中的应用，具体涉及到潜手性茚酮的不对称还原及多靶点治疗轻度认知功能障碍药物(R)-拉多替吉的手性中间体的制备应用。
技术介绍
光学活性手性醇作为一种可以引入手性中心的重要砌块，在药物、精细化学品、农用化学品和其他特殊材料的合成中应用十分广泛。不对称还原前手性酮是一种简单、可靠而且直接的生产光学活性手性醇的方法。与传统金属和有机催化等化学合成技术相比，羰基的不对称生物还原具有立体选择性强、原子利用率高以及生产过程对环境友好等优势。酮还原酶，也叫作羰基还原酶，或者醇脱氢酶，是一种可以将酮羰基还原成相应醇的氧化还原酶。光滑假丝酵母酮还原酶(CgKR1)最初由沈乃东等通过基因挖掘的方法发现(Adv.Synth.Catal.2012,354,1765–1772)，并通过定向进化方法提高其稳定性及对邻氯苯甲酰基甲酸甲酯(Methylo-Chlorobenzoylformate,CBFM)的活性(JournalofBiotechnology,2015,203:54-61.)。手性茚醇类化合物具有广泛的药理活性，例如抗帕金森氏病药物雷沙吉兰，多靶点认知功能障碍(MCI)的候选药物拉多替吉的结构中就含有该结构片段。相比手性α-苯基取代的脂肪醇的研究，手性茚醇的研究成果较少，主要是因为环状结构立体位阻较大，不利于手性催化剂或酶的定向选择。在前期工作的基础上，我们选用四种潜手性茚酮底物1a-4a进行研究，并进一步选用拉多替吉中间体4a作为我们的研究目标，探索该方法的应用价值。拉多替吉(Ladostigil)是一种新型的治疗轻度认知功能障碍(MCI)的候选药物，其R型异构体的活性和安全性都远远好于S型异构体。药理研究证明小剂量的拉多替吉具有很好的神经保护作用(CurrDrugTargets,2012,13(4):483-494.)。目前拉多替吉的合成路线主要为以下三条：路线1：WO9827055A1Chorev等首次报道的路线，采用(R)-1-氨基茚满为原料，成本较高，反应步骤长，反应收率较低，造成手性原料的很大浪费。路线2：JournalofOrganicChemistry,2006,71,4130-4140.Herzig等报道的路线，较简单，但得到的产物为消旋体，需拆分出R型对映体，而另外50％的S-构型需要弃去。路线3：US20060199974A1本路线中，关键步骤采用Ru-TsDPEN催化氢转移反应，将酮转变为S-手性醇，再经过亲核取代反应得到R-构型拉多替吉。该路线的问题是催化剂用量大，且多步反应收率较低。黎星术等对此法进行改进(Tetrahedron:Asymmetry,2012,23,333-338.)，关键步骤采用Ru-Cs-DPEN催化剂在含表面活性剂的甲酸钠-水体系中进行，收率为67％，e.e.值为89％，但金属残留及e.e.值不高的问题仍限制了其应用。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供一种酮还原酶突变体。本专利技术还提供了所述的酮还原酶突变体作为催化剂在制备手性茚醇类化合物的应用。本专利技术由野生型光滑假丝酵母酮还原酶1(Candidaglabrataketoreductase1，CgKR1)基因(SEQIDNO.1)通过突变得到具有改良性质的酮还原酶突变体，并在大肠杆菌工程菌中表达。所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任意序列具有至少90％同源性。其中序列SEQIDNO.2来自野生型CgKR1，其他序列通过定点突变方法获得。该酮还原酶突变体对茚酮类底物具有不同活性及选择性，能将茚酮类化合物选择性还原为不同构型的茚醇。进一步地，本专利技术所述的酮还原酶突变体的序列如SEQIDNO.4、6、8、10、12、14、16或18所示。本专利技术提供了一种核酸。优选地，所述的核酸选自SEQIDNO.3、5、7、9、11、13、15或17中的任一核酸序列。其表达的蛋白如上文所示。本专利技术提供一种表达载体，该载体包含编码上述酮还原酶突变体的核酸且能在宿主细胞中进行表达。本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术还提供了一种使用上述酮还原酶突变体制成的生物催化剂(包括全细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式)催化茚酮类化合物的对映选择性还原的方法。所述方法以潜手性茚酮类化合物为底物，在适于将其还原为手性茚醇的反应条件下与本专利技术中的生物催化剂接触。所述的生物催化剂是由上述酮还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达在同一宿主细胞中制成的全细胞催化剂；本专利技术中，葡萄糖与GDH构成辅酶再生系统，常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学等方法，优选地为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。所述反应是在辅酶存在下，在pH5～7、温度为25～40℃的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，在生物催化剂作用下进行的，其中，所述的辅酶为NADP+，所述所述的磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4/NaH2PO4)浓度为100mM，pH6.0。上述方法中的潜手性茚酮类化合物如式(I)所示，(I)其中，R1可以为苯环上的单取代基或多取代基，可以为H、羟基、氨基、巯基、C1～C5饱和或不饱和烷基、C1～C4烷基氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C4酰胺基。R2可以为羟基、酮羰基、C1～C5烷基、C1～C4烷基氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C4酰胺基等取代基。优选地，R1为H、羟基、甲氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C5烷基；R2为H、酮羰基、C1～C5烷基。本专利技术合成了化合物1a、2a、3a、4a，并在生物催化剂的作用下，制备化合物1b、2b、3b、4b。本专利技术的主要反应步骤如下：1.化合物1a的合成：3-苯丙酸经多聚磷酸(PPA)脱水环合得到化合物1a。反应温度80～100℃，以90℃为宜。本反应中PPA既作为溶剂又作为脱水剂。2.化合物3a的合成2.1对甲氧苯丙酸的合成对甲氧苯甲醛与米氏酸经克脑文格尔缩合、还原、脱羧，得到对甲氧苯丙酸。其中，对甲氧苯甲醛与米氏酸的摩尔比为1:1～1:1.5，对甲氧苯甲醛与甲酸的摩尔比为1:1.5～1:2.5。优选地，对甲氧苯甲醛、米氏酸、甲酸、三乙胺的摩尔比为1:1:3:1.2。2.2化合物3a的合成对甲氧苯丙酸与氯化亚砜反应制得酰氯，后者在三氯化铝催化下化合得到化合物3a。其中，对甲氧苯丙酸与氯化亚砜的摩尔比为1:1.5～1:8，对甲氧苯丙酸与三氯化铝的摩尔比为1:1～1:2。优选地，对甲氧苯丙酸、氯化亚砜、三氯化铝的摩尔比为1:7.8:1.1。3.化合物2a的合成化合物3a与无水三氯化铝反应，脱甲基得到化合物2a。其中，化合物3a与无水三氯化铝的摩尔比为1:2.5～1:4，以1:3为宜。4.化合物4a的合成在干燥乙腈中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任意序列具有至少90％同源性。

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任意序列具有至少90％同源性。2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16或18的任意序列。3.一种核酸，其能够编码权利要求1或2中所述的酮还原酶突变体。4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述的核酸选自SEQIDNO.3、5、7、9、11、13、15或17中的任一核酸序列。5.一种表达载体，该载体含有权利要求3或4所述的核酸且能在宿主细胞中进行表达。6.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的表达载体。7.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌。8.权利要求1或2所述的酮还原酶突变体在制备手性茚醇中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾娴，欧阳敬平，秦凤玉，游松，李裕鑫，林春瑜，骆训邦，王婧朱，韩冰洋，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21