基于代谢工程优化进行葡萄糖氧化酶分泌表达的方法、重组菌及其应用技术

本发明专利技术涉及基于代谢工程优化分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的方法、重组菌及其应用。本发明专利技术提供了一种能够高效地分泌表达GOD、提高其酶活的方法，所述方法通过在酵母菌株中共表达GOD和苹果酸脱氢酶1编码基因(mdh1)或6‑磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因(sol3)，实现GOD的高效表达。同时，本发明专利技术还提供了以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主构建的高效分泌GOD的重组菌。

Method of glucose oxidase secretion expression based on metabolic engineering optimization, recombinant bacteria and their application

The present invention relates to a method for optimizing secretory expression of glucose oxidase (GOD) based on metabolic engineering, recombinant bacteria and their applications. The present invention provides an efficient method to improve the expression and secretion of GOD, the enzyme activity, the method based on yeast strains co expressing GOD and malate dehydrogenase 1 gene encoding (mdh1) or 6 phosphate gluconolactonase (sol3) encoding gene, efficient expression of GOD. At the same time, the invention also provides with yeast (Pichia pastoris) as the host building efficient secretion of recombinant bacterium GOD.

【技术实现步骤摘要】
基于代谢工程优化进行葡萄糖氧化酶分泌表达的方法、重组菌及其应用
本专利技术属于生物工程
，更具体地，本专利技术涉及基于代谢工程优化进行葡萄糖氧化酶分泌表达的方法、重组菌及其应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOD)广泛应用于食品、化工、医药、生物技术等领域。基于葡萄糖氧化酶催化反应的特异性，可用于生物传感器。葡萄糖氧化酶是用来检测血液中葡萄糖浓度传感器的核心成分，固定在传感器电极上的GOD可将血液中微量的葡萄糖转化成容易测定的过氧化氢，铂电极检测到的过氧化氢越多，电信号就越强。利用葡萄糖氧化酶做成的血糖仪可方便地检测糖尿病患者血糖的波动水平。葡萄糖氧化酶广泛应用于食品行业中。用于食品除氧保鲜，在商品真空袋中加入少许葡萄糖氧化酶和葡萄糖，可以将真空袋中氧气耗尽，从而抑制微生物的生长和繁殖，延长食品的保质期。去除蛋白制品中的葡萄糖。鸡蛋的蛋白中含有0.5％～0.6％的葡萄糖，在贮存和加工的过程中，葡萄糖的羰基和蛋白质的氨基发生了梅拉德反应，会在蛋白中出现小黑点。加入GOD可以消耗掉葡萄糖，从而保证蛋白质的质量。可作为食品添加剂加入到面粉中。Bonet等发现，GOD能够和面团中的葡萄糖反应，产生过氧化氢，在过氧化氢的帮助下，面筋蛋白可以形成二硫键，进而形成复杂的网络结构，这种结构能够增强面团的劲道，提升面制品的口感。此外，过氧化氢还能够改变面粉的色泽，使面制品的外貌变得美观。在纺织业中，GOD常被应用于漂白脱色工艺。由于GOD催化β-D-葡萄糖的过程中，产生了强氧化性的过氧化氢，很难重复使用GOD。Tzanov等人将GOD共价固定在矾土和玻璃支撑物上，提高酶重复利用率。大约450分钟后，固定在玻璃支撑物的最大过氧化氢浓度达到了0.35g/L，而在矾土上是0.24g/L，与标准漂白工艺相比，纺织品上的过氧化氢浓度大致在同一水平，增加了GOD的重复使用率。GOD在低酒精酿造工艺中有很大的潜力。在白酒生产中加入葡萄糖氧化酶后，发现白酒中的酒精含量降低了2％，使白酒变得口味纯正，不产生沉淀、浑浊等现象。发酵过程中，GOD能够杀死乙酸菌和乳酸菌，GOD的杀菌作用意味着GOD不能广泛应用在酿酒生产中，Pickering等使用GOD/CAT双酶系统处理葡萄汁，降低了乙醇含量，87％的葡萄糖转化成葡萄糖酸。现阶段，葡萄糖氧化酶还被应用在生物燃料电池行业中，将过氧化氢酶和GOD固定在同一电极上，由于GOD催化葡萄糖反应是氧化还原反应，所以电子能够转移到另一端的碳电极上，从而形成了绿色环保的生物燃料电池，可以为生物传感器和人造器官提供持续的能源。在口腔中，链球菌的存在通常会提升蛀牙的几率，可以在牙膏中加入GOD，能够和口腔残留的葡萄糖反应，产生的过氧化氢能起到抑制有害菌的滋生和繁殖，从而降低患口腔疾病的概率。葡萄糖酸及其衍生物广泛应用在保健品行业中，而GOD作为葡萄糖酸生产中的关键酶，既可以单独使用进行酶法生产，也可以在利用黑曲霉生产的过程中通过添加GOD来快速合成葡萄酸，提高葡萄糖酸的产量。目前，本领域通过微生物发酵的方法生产GOD，但是，利用黑曲霉或青霉发酵生产GOD存在着酶产量低、分离纯化胞内酶困难等问题。而利用大肠杆菌生产GOD，无法对GOD进行翻译后加工，合成的GOD无活性。本领域技术人员也利用毕赤酵母生产GOD，但是产量及酶活性尚不够理想，还需要进一步地优化GOD的生产工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于代谢工程的分泌表达葡萄糖氧化酶的方法、重组菌及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种利用酵母细胞表达葡萄糖氧化酶的方法，所述方法包括：(1)在酵母细胞中引入外源的葡萄糖氧化酶编码基因；(2)在步骤(1)的酵母细胞中引入外源的选自下组的至少一种基因：苹果酸脱氢酶1编码基因，6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因；(3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶，所述的葡萄糖氧化酶为高酶活的葡萄糖氧化酶。在一个优选例中，葡萄糖氧化酶编码基因，苹果酸脱氢酶1编码基因或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中。在另一优选例中，所述方法包括：(1)提供表达载体，所述表达载体中包含葡萄糖氧化酶编码基因的序列，将该表达载体转入到酵母细胞中；(2)提供表达载体，所述表达载体中包含苹果酸脱氢酶1编码基因或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因的序列，将该表达载体转入到步骤(1)的酵母细胞中；(3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶。在另一优选例中，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。在另一优选例中，以AOX1启动子驱动外源的葡萄糖氧化酶编码基因的表达，以AOX1启动子驱动外源的6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因的表达。在本专利技术的另一方面，提供一种制备高酶活的葡萄糖氧化酶的表达细胞的方法，所述方法包括：(1)在酵母细胞中引入外源的葡萄糖氧化酶编码基因；(2)在步骤(1)的酵母细胞中引入外源的选自下组的至少一种基因：苹果酸脱氢酶1编码基因，6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因；(3)分离出携带有外源的葡萄糖氧化酶编码基因，外源的选自下组的至少一种基因：苹果酸脱氢酶1编码基因，6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因的重组酵母细胞。在本专利技术的另一方面，提供一种高酶活的葡萄糖氧化酶的表达细胞，其是酵母细胞，其基因组中整合有：外源的葡萄糖氧化酶编码基因(较佳地，其以AOX1启动子驱动表达)；以及外源的选自下组的至少一种基因：苹果酸脱氢酶1编码基因，6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因(较佳地，其以AOX1启动子驱动表达)。在一个优选例中，所述的外源的葡萄糖氧化酶编码基因，外源的苹果酸脱氢酶1编码基因或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中；较佳地，所述的酵母细胞是通过前面所述的方法制备获得。在本专利技术的另一方面，提供一种用于生产高酶活的葡萄糖氧化酶的试剂盒，所述试剂盒中包括：前面任一所述的酵母细胞。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、质粒pPIC9K-GOD构建。图2、PCR扩增GOD基因。LaneM：Marker5,000；Lane1，2：以质粒pUC57-GOD为模板，GODF/GODR为引物。图3、酶切验证质粒pPIC9K-GOD。LaneM：Marker15,000；Lane1：pPIC9K-GOD经BamHI和SalI消化(3982bp和7037bp)。图4、PCR验证重组菌G/GODM。LaneM：Marker5,000；Lane1：以P.pastorisGS115基因组DNA为模板；Lane2、3：以重组菌G/GODM基因组DNA为模板。Lane1、2、3：以GODF/GODR为引物。图5、表达载体pAOX-sol3、pAOX-mdh1、pAOX-zwf1、pAOX-gdh3的构建示意图。图6、表达载体pAOX-zwf1、pAOX-sol3、pAOX-gdh3、pAOX-mdh1的双酶切验证。LaneM：Marker15,000；Lane1：pAOX-zwf1经XhoΙ和NotΙ消化；Lane2：pAOX-sol3经XhoΙ和NotΙ消化；Lane3：pAOX-gdh3经XhoΙ和NotΙ消化；Lane4：p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用酵母细胞表达葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在酵母细胞中引入外源的葡萄糖氧化酶编码基因；(2)在步骤(1)的酵母细胞中引入外源的选自下组的至少一种基因：苹果酸脱氢酶1编码基因，6‑磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因；(3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶，所述的葡萄糖氧化酶为高酶活的葡萄糖氧化酶。

【技术特征摘要】
1.一种利用酵母细胞表达葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在酵母细胞中引入外源的葡萄糖氧化酶编码基因；(2)在步骤(1)的酵母细胞中引入外源的选自下组的至少一种基因：苹果酸脱氢酶1编码基因，6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因；(3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶，所述的葡萄糖氧化酶为高酶活的葡萄糖氧化酶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，葡萄糖氧化酶编码基因，苹果酸脱氢酶1编码基因或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供表达载体，所述表达载体中包含葡萄糖氧化酶编码基因的序列，将该表达载体转入到酵母细胞中；(2)提供表达载体，所述表达载体中包含苹果酸脱氢酶1编码基因或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶编码基因的序列，将该表达载体转入到步骤(1)的酵母细胞中；(3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，以AOX1启动子驱动外源的葡萄糖氧化酶编码基因的表达，以AOX1...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱江潮，魏东升，王泽建，段广东，吴凡，储炬，庄英萍，张嗣良，肖慈英，黎亮，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31