一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法及转基因烟草材料技术

本发明专利技术提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，以植物病原真菌细胞膜上的麦角甾醇为靶点，利用分子改良手段在spCEMA的C末端融合麦角甾醇结合域ErBD，并获得相应的融合抗菌肽基因（如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列），构建植物表达载体后导入野生型烟草中组成性表达。相比野生型spCEMA，获得的spCEMA::ErBD转基因烟草对植物病原菌的抗性显著提高，表明利用分子靶向技术对已有抗菌肽进行定向改良在植物抗病基因工程上具有巨大的应用潜力。

Method for improving resistance of spCEMA to plant pathogenic bacteria and transgenic tobacco material

The method of improving spCEMA on plant pathogenic bacteria resistance to plant pathogenic fungi, ergosterol on the cell membrane as a target, using the means of molecular improvement at the spCEMA end of the C fusion ergosterol binding domain ErBD, and obtain the corresponding fusion antibacterial peptide gene (amino acid sequence of SEQ ID NO. shows 1 nucleotide sequence ID NO. and SEQ shown in Figure 2), the construction of plant expression vector expressing a constitutively wild-type tobacco. Compared with the wild type spCEMA, the spCEMA:: ErBD transgenic tobacco resistance to plant pathogens increased significantly, that of directional modification of existing technology to the antibacterial peptide has potential application in genetic engineering of plant disease resistance using molecular target.

【技术实现步骤摘要】
一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法及转基因烟草材料
本专利技术涉及一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，还涉及spCEMA::ErBD的植物表达载体。属于植物基因工程

技术介绍
在农业生产中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制农作物产量提高的重要因素。长期以来，广泛采用的防治手段主要为化学防治，但由于病原菌变异速度快，会对各种化学农药产生耐药性或抗药性，同时农药所带来的环境污染和生态平衡问题也不容忽视。因此，为保障食品安全，减少化学防治方法对环境的破坏，急需开发高效并对环境安全的植物病害防治手段。近年来，基因工程在植物抗病的研究上已经取得了初步的进展。研究表明，在植物中表达不同来源的抗菌肽基因能显著增强植物对病原菌的抗病性（Gaoetal.,2000;Jaynesetal,1993;Jhaetal.,2009）。但利用抗菌肽获得的转基因植物材料抗病能力较差，还不能满足生产的的需要。为获得高效的植物抗病基因，除继续在不同物种中筛选、克隆抗菌肽基因外，利用分子进化手段对抗菌肽进行定向改良，在现有基础上提高其抗菌效果是一条较为有效的途径。现有研究发现，不同的抗菌肽具有不同的抑菌机制，包括结合并破坏真菌细胞膜，穿过细胞膜进入细胞中抑制不同的靶标等。因此，与真菌细胞膜的互着是抗菌肽发挥抑菌活性的重要步骤。我们设想，如能增加抗菌肽在真菌细胞膜上的富集能力，将提高抗菌肽的抑菌效果。在真菌中，麦角甾醇是细胞膜上独特的脂类成分，能够调控真菌细胞膜的流动性和渗透性，是细胞生存的关键因子（Sanglardetal.,2003）。CEMA是由杀菌肽ceropinA的N-端8个氨基酸和经改造的蜂毒素C-末端组成的阳离子抗菌肽，我们实验室进一步在其N端添加信号肽获得了spCEMA（牛国清等，２００２）。将spCEMA导入植物中，可提高植物抗病性，但提高幅度仍有限。在本专利技术中，以真菌细胞膜上的麦角甾醇为靶标，利用分子改良手段在现有抗菌肽spCEMA上添加麦角甾醇结合域ErBD（Luccaetal.,1998），提高对植物病原真菌的靶向性和富集能力，从而达到理想的抗菌效果。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，解决目前植物抗病基因工程中抗菌肽的抑菌效果不理想的问题，利用分子改良手段在spCEMA的C末端融合麦角甾醇结合域ErBD，提高抗菌肽在植物病原菌细胞膜上的靶向性和富集能力，从而进一步增强转基因植物对病原菌的抗性。本专利技术还提供该融合抗菌肽基因的植物表达载体及转基因烟草材料。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，以植物病原真菌细胞膜上的麦角甾醇为靶点，利用分子改良手段在spCEMA的C末端融合麦角甾醇结合域ErBD，并获得相应的融合抗菌肽基因；如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，构建植物表达载体。进一步，具体步骤为：由于麦角甾醇结合域ErBD和spCEMA的分子量小，采用人工合成的方式（常州基宇生物科技有限公司）获得两端分别添加BamHI与EcoRI酶切位点、中间用linker序列连接的融合抗菌肽，并连接于大肠杆菌克隆载体pUC57上，命名为pUC57-spCEMA::ErBD。随后，BamHI与EcoRI酶切pUC57-spCEMA::ErBD，回收spCEMA::ErBD片段，并与植物表达载体进行连接，获得正确的spCEMA::ErBD植物表达载体。一种融合抗菌肽基因的转基因烟草材料，利用构建的上述植物表达载体，经遗传转化后导入野生型烟草中组成性表达。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术利用分子改良手段在spCEMA的C末端融合了麦角甾醇结合域ErBD，并获得一个新的融合抗菌肽基因。与野生型抗菌肽相比，改良后的抗菌肽能更加有效的抑制植物病原真菌的萌发及生长。2、本专利技术将融合抗菌肽基因导入野生型烟草中，获得相应的转基因烟草。结果显示，相比野生型spCEMA，获得的spCEMA::ErBD转基因烟草对植物病原菌的抗性显著提高。表明经分子改良后的spCEMA::ErBD在植物抗病基因工程中具有较好的应用前景。3、随着转基因技术的发展，越来越多的抗菌肽已被应用到植物抗病基因工程中。然而，天然抗菌肽仅有限提高转基因植株对病原菌的抗性，还不能满足生产需要。因此，植物抗病基因工程的关键是获得高效、特异的抗病基因。本专利技术中利用植物病原菌细胞与植物细胞在结构及组成成份上存在差异，以植物病原真菌细胞膜上特有的麦角甾醇为靶点，通过定向改良手段在spCEMA的C末端融合麦角甾醇结合域ErBD，获得相应的融合抗菌肽，提高其对植物病原真菌的靶向性和富集能力，在相同浓度下，增强抗菌肽对病原真菌的抑制效果，同时减少对非靶标细胞的危害。附图说明图1spCEMA::ErBD植物表达载体的酶切验证；图中M2000表示marker2000（Bioer公司）M15表示marker15（Fermentas公司）；泳道1-5表示不同spCEMA::ErBD植物表达载体转化子经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切的结果。图2spCEMA::ErBD植物表达载体图谱；其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡那霉素抗性；CaMV35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。图3转基因烟草的GUS染色；Transgenic代表的是转基因烟草的GUS染色结果；Non-transgenic代表的是非转基因烟草的GUS染色结果。图4转基因烟草表达量筛选；横坐标表示不同转基因烟草的转化子，其中spCEMA::ErBD-4和spCEMA::ErBD-42代表的是spCEMA::ErBD转基因株系，spCEMA-44和spCEMA-46代表的是spCEMA转基因株系，WT表示野生型烟草植株；纵坐标表示不同植株中外源基因的相对表达水平。图5转基因烟草叶片离体抗病性比较；A：转基因烟草叶片对大丽轮枝菌的抗性比较；B：转基因烟草叶片对烟草赤星病的抗性比较。WT表示野生型烟草叶片；spCEMA表示spCEMA转基因烟草叶片；spCEMA::ErBD表示spCEMA::ErBD转基因烟草叶片；Water表示经水处理的野生型叶片。图6转基因烟草叶片总蛋白提取液对油菜黑斑病原菌的抗性比较；WT表示野生型烟草叶片总蛋白提取液；spCEMA表示spCEMA转基因烟草叶片总蛋白提取液；spCEMA::ErBD表示spCEMA::ErBD转基因烟草叶片总蛋白提取液；KPB表示磷酸盐缓冲液。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术提供一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，利用分子改良手段将麦角甾醇结合域ErBD，融合到spCEMA的C末端，其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。【实施例1】spCEMA::ErBD基因的获取由于麦角甾醇结合域ErBD和spCEMA的分子量小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，其特征在于，以植物病原真菌细胞膜上的麦角甾醇为靶点，利用分子改良手段在spCEMA的C末端融合麦角甾醇结合域ErBD，并获得相应的融合抗菌肽基因；如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，构建植物表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，其特征在于，以植物病原真菌细胞膜上的麦角甾醇为靶点，利用分子改良手段在spCEMA的C末端融合麦角甾醇结合域ErBD，并获得相应的融合抗菌肽基因；如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，构建植物表达载体。2.根据权利要求1所述提高spCEMA对植物病原菌抗性的方法，其特征在于，具体步骤为：由于麦角甾醇结合域ErBD和spCEMA的分子量小，采用人工合成的方式获得两端分别添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：范艳华，童胜，李先碧，金丹，裴炎，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50