骨形态发生蛋白２活性肽及制备方法和应用技术

一种骨形态发生蛋白２活性肽，其特征在于其结构为：Ｃ↓［１６］Ｈ↓［３１］Ｏ－ＮＨ－ＣＣＣＣＧＧＧＳ↑［［ＰＯ４］］－ＫＩＰ－ＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬ。它克服了现有ＢＭＰ－２半衰期短，难以持续的发挥作用以及生产设备、制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，价格亦非常昂贵，难以大规模生产等不足。具有活性位点能充分暴露、其异位成骨能力较强；较易大规模合成，费用更低，稳定性更好，持续时间长等优点。本发明专利技术还同时公开了这种骨形态发生蛋白２活性肽的制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于临床医学领域，更具体地说它涉及一种骨形态发生蛋白2活性多肽及这种 活性多肽的制备方法及其在医学上促进骨再生、骨缺损修复上的应用。技术背景据统计，我国每年因各类交通事故、生产安全事故、骨科疾病等因素，造成骨缺损或 骨损伤的患者有300万人，而且有逐年增多的趋势，急需大量骨修复材料，市场巨大。随 着科技的进歩，临床上通过实施自体或异体组织移植、使用人工合成骨组织代用品，使得 上述疾病的治疗取得了很大进展。但其缺点是均存在牺牲个体正常组织、供体来源不足、 价格昂贵、产生排异反应和继发感染等问题，不能满足临床治疗的要求。目前，如何从根 本上解决骨缺损的修复已成为国际医学前沿课题。近年来，用组织工程学技术，即用人工细胞外基质材料、生长因子与种子细胞复合移 植或单独植入修复骨缺损，引起各国高度重视。但目前国内外骨相关研究尚处于起歩阶段， 有许多问题亟待解决，其中如何研制出具有显著修复骨缺损效果的药物或材料是亟待解决 的关键问题之一。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,简称BMPs)是一种存在于骨基质中的糖 蛋白多肽，含有二硫键结构，相对分子质量18000-30000，除骨形态发生蛋白l外构成了 一个结构和功能相似的多肽因子家族。到目前为止，已发现的骨形态发生蛋白家族成员有 43种。骨形态发生蛋白是目前唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，能在生物体 内诱导未分化的间质细胞分化成为软骨和骨。骨形态发生蛋白各成员的诱导成骨能力不 同，其中以骨形态发生蛋白2的成骨能力最强，因此目前被广泛研究。然而，BMP-2是一种量微高效的粉末状物质，既不能均匀地分布于骨缺损处，又无支 撑作用。同时，由于骨形态发生蛋白2在体内半衰期短，局部应用时代谢较快，要求相对 大的剂量才能刺激足量骨形成而持续的发挥治疗作用，从而增加临床治疗的成本并可能导 致毒性作用的产生。如何大规模的生产BMP-2并使其在临床上更加广泛地发挥作用一直是 当前研究的一个难点。H前国内外多采用分子生物学和基因工程学等技术生产基因重组人骨形态发生蛋白 2(rilBMP-2)。但由于其生产设备和制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，价格亦非常 品贵，难以大规模生产，同时亦存在基因工程产品安全性的问题(Wozney J, Seeherman H. Protein-based tissue engineering in bone and cartilage repair. Curr Opin Biotechnol, 2004, 15(5): 392-398.)。临床上，人们运用无机材料、高分子多聚体、生物性材料、复合材料等作为BMP-2 或rhBMP-2载体应用于治疗。但由于各种材料在生物相容性、力学性能、骨传导性、骨诱 导性、可塑性。可降解性等方面各有差异，目前还没有一种完全具备理想骨缺损修复材料 要求的骨组织代用品。这样就限制了外源性BMP2或rhBMP-2在骨折治疗中的应用。另外， 大分子蛋白质吸附在材料表面后会随机折迭，活性位点暴露不充分导致其生物活性不高。另一种方法是运用转基因技术将BMP-2基因转入骨髓间充质干细胞，通过转基因细胞 表达BMP-2。目甜报道的骨形态发生蛋白2基因载体多为腺病毒，病毒类载体有持续增殖 对宿主造成危害的可能，同时外源性基因的介入也使宿主基因存在突变的危险；非病毒载 体转入的外源性基因不会整合入宿主细胞的染色体中，不会使插入位点的基因过度表达和 失活，也汜插入突变的危险，但其表达效率较低。此外，基因在体内的表达时间和表达数 量还不能人为控制。然而亦存在转染效率低、表达时间较短及病毒载体的潜在致癌性等缺 /,',((Chadderdon R, Shimer A， Gilbertson L. Advances in gene therapy for intervertebral disc degeneration. Spine J. 2004， 4(6Suppl): 341S-34.)(因此，以BMP-2为基础的基因治疗还远 远不能运用于临床。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种骨形态发生蛋白2活性肽。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述骨形态发生蛋白2活性肽的方法。 本专利技术的再一个目的是将本专利技术骨形态发生蛋白2活性肽在临床上应用于促进骨再 生、骨缺损的修复。本专利技术的目的是通过如下措施来达到一种骨形态发生蛋白2活性肽，其结构为S(P04JKIPKASSVPTELSAISTLYLDDDCt形态发生蛋白2活性肽1);或CCCCDDDS'pwKIPKASS VPTELS AISTLYL(骨形态发生蛋白2活性多肽2);或C, 6H3,0-N H-CCCCGGGS 1P04]-KIPKASS VPTELS AISTLYL(骨形态发生蛋白2活性肽3)。制备上述骨形态发生蛋白2活性肽的方法为BMP-2氨基酸序列中的BMP-2II型受体具有很多抗原表位，其特征性的"指节抗原表 位:"(Kirsch T, Sebald W, Dreyer MK. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat Struct Biol, 2000, 7(6): 492-496.)中具有诱导成骨的核心功能区，其核心功能区中氨基酸 序列为"KIPKASSVPTELSAISTLYL" (Saitoa A, Suzuki Y, Ogataa S， et al. Activation of osteo-progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogenetic protein-2 knuckle epitope. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1651: 60—67.)在其一端加上一个磷酸化的丝氨酸，另外一端加上三个天冬氨酸，形成的骨形态发生 蛋白2活性肽l(Sfro4]KIPKASSVPTELSA[STLYLDDD);或在其 -端加上四个半胱氨酸，三个天冬氨酸以及一个磷酸化的丝氨酸，形成的骨形 态发生蛋白2活性肽2(CCCCDDDS[P04JKIPKASSVPTELSAISTLYL)。或在其一端加上四个半胱氨酸，三个甘氨酸以及一个磷酸化的丝氨酸，其中位于多肽 链的端侧的一个半胱氨酸用软脂酸酯((^H^O-)加以修饰，形成骨形态发生蛋白2活性肽 3(Cl6H3iO- NH- CCCCGGGS[P04-KIPKASSVPTELSAISTLYL)。H条多肽均通过常规的FMOC/tBu固相多肽合成法合成(Barany Q Merrifield RB. 1979. Solid phase peptide synthesis. In: Gross E, Meienhofer J. eds. The peptides uol2. New York AcademiPc ress. pp l-284.):采用对碱不稳定的9-芴甲基羰基(Fmoc)保护氨基酸的a-氨基， 釆用对酸不稳定的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种骨形态发生蛋白２活性肽，其特征在于其结构为：Ｓ↑［［ＰＯ４］］ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬＤＤＤ、或ＣＣＣＣＤＤＤＳ↑［［ＰＯ４］］ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬ、或Ｃ↓［１６］Ｈ↓［３１］Ｏ－ＮＨ－ＣＣＣＣＧＧＧＳ↑［［ＰＯ４］］－ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓东，郑启新，袁泉，段德宇，刘建湘，段智霞，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]