重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种在大肠杆菌以包涵体形式表达重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)的制备方法，其包括如下主要步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节不同pH值、尿素变性溶解所述包涵体蛋白、所述包涵体蛋白质的控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤。本发明专利技术的制备方法利用在漂洗过程中通过数次调节不同pH值和控制尿素浓度改变速度进行复性、并且通过超滤膜技术即可制备纯度高、活性高的rhBMP-2。同时可以省略层析步骤，通过现代超滤膜技术即可满足产品质量要求，大大缩短了工时、降低了生产成本。本发明专利技术可高效、简便、低成本地获得rhBMP-2纯品。

【技术实现步骤摘要】
重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法
本专利技术涉及从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人骨形态发生-2的方法，属于蛋白质生物化学工程领域。
技术介绍
骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)为Urist于1963年发现(MarshallR.UristmR.Boneformationbyautoinduction.Science,1965,150:893)，能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。BMP最初被认为是软骨和骨形成的蛋白质调节剂(MarshallR.Uristm.Thesubstratumforbonemorphogenesis.DevBiol(Suppl),1971,4:125)，但他们随后表现出与各种组织和器官的胚胎发育和形态发生有关的性质。同时BMP也表现出调节各种细胞的生长、分化和趋药性的作用，包括间充质细胞、上皮细胞、造血细胞和神经细胞。骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复。研究表明，BMP-2主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化作用(RileyeA,LaneJM,UristMR,etal.Bonemorphogeneticprotein-2:Biologyandapplication.ClinicOrthop,1996,324:39)。在骨形成早期，BMP-2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞。其主要过程是：增加或抑制这些细胞内的某些特异性蛋白的分泌，使成纤维细胞分化为成骨细胞，成肌细胞快速分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化。在骨形成后期，BMP-2还作为一种破骨细胞分化因子与其它支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建(Kaffagirit,YamaguchA,etal.Bonemorphogeneticprotein-2convertsthedifferentiationpathwayofC2C12myoblastintotheosteoblastlineage.J-Cell-Biol,1994,127:1755；Kanatanit,YamaguchA,IkedaT,etal.Thenon-osteogenicmousepluripotentcellline,c3H10Ti/2,isinducetodifferentiateintoosteoblasticcellbyrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2.Biochem-Biophys-Res-Commun,1990,192(1):295；LongmW,RobinsonJA,AshcraftEA,etal.Regulationofhumanbonemarrow-deriyedosteogenitorceelsbyosteogenicgrowthfactors.JClinInvest,1995,95:881)。BMP-2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠。成熟的BMP-2以二聚体形式才具有生物活性。目前，人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组BMP-2(rhBMP-2)，并且在常位和异位成功地诱导出新骨(胡蕴玉.骨诱导及BMP的研究现状与展望.中华骨科杂志，1996，34(10)：579)。BMP-2在临床中的应用展示广阔的前景(金岩，司晓辉，杨连甲等.骨形态形成蛋白在下颌骨骨折中的表达及mRNA水平分析.中华创伤，1996，12(6)：353)。本重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)单体含全部114个氨基酸残基，单体分子量12.9KD，它的同二聚体具有与天然骨形态发生蛋白-2相当的生物活性。目前，利用大肠杆菌表达重组人BMP-2，有两种不同的技术途径，一种是生产分泌型的重组人生长激素，一种则是生产胞内型。经无数次实践验证，生产分泌型的重组人生长激素，虽然步骤简单，但其表达量很低，成本也极其高，不能满足市场的需要。重组胞内型的人生长激素蛋白，其表达量非常大，但复性效果往往不好，复性后的蛋白质折叠不好，稳定性差，蛋白活性低。基于现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种改良的重组人生长激素的制备的方法，较容易获得大量的高纯度和活性高的蛋白。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种，从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，所述方法包括：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节不同pH值、变性溶解所述包涵体蛋白、所述包涵体蛋白控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品步骤。在本专利技术的一个方面，所述漂洗包涵体和调节不同pH值步骤是用含有0.1-5％的去污剂的去离子水和调节pH至2-10，漂洗包涵体3-5次；所述去污剂为曲拉通X-100。在本专利技术的又一个方面，所述包涵体蛋白尿素控速复性步骤为：添加水或缓冲液降低尿素浓度来实施的。所述尿素复性该包涵体蛋白步骤是通过控制添加水或缓冲液的流速来实现的；所述控制添加水或缓冲液的流速为1-100mL/分钟，优选为2-20mL/分钟，最优选为5mL/分钟。在本专利技术的再一个方面，所述超滤膜浓缩的步骤是用截留分子量为10000道尔顿-35000道尔顿的超滤膜进行反复超滤浓缩。在本专利技术的一个具体方面，本专利技术提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为8.5-10.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.0-8.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为2.0-6.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mMBeta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人骨形态发生蛋白‑2的制备方法，其包括如下步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节不同pH值、变性溶解所述包涵体蛋白、所述包涵体蛋白控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品步骤。

【技术特征摘要】
2014.06.17 CN 201410270903.11.一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为8.5-10.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.0-8.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为2.0-6.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mMBeta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；10)用截留分子量为1000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；12)用截留分子量为26000-35000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；13)用截留分子量为1000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.5-7.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；5)加入10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爽，邓小霞，庞玉，王子华，孙晓悦，
申请(专利权)人：吉林省金梓源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22