本发明专利技术提供一种适合大肠杆菌分泌表达重组蛹虫草超氧化物歧化酶(recombinant cordyceps militaris superoxide dismutase，rcSOD)的信号肽核苷酸序列和编码蛹虫草SOD的SOD核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从该工程细胞纯化rcSOD的方法。优化后的超氧化物歧化酶基因非常适合大肠杆菌表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。本发明专利技术可高效、简便、低成本地获得rcSOD纯品。本发明专利技术还包括通过上述方法制备的重组蛹虫草超氧化物歧化酶在制备治疗与人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大肠杆菌分泌表达重组冬虫夏草超氧化物歧化酶的编码信号肽的核 苷酸序列和编码冬虫夏草S0D的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体 的工程细胞和从该工程细胞纯化rcSOD的方法及其用途，属于基因工程和蛋白质生物化学 领域。
技术介绍
超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，S0D)是一种能够催化超氧化物通过歧 化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要 的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜 (Cu)锌（Zn)金属辅基的称（Cu.Zn-SOD)，最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞 浆中；第二种是是含锰（Mn)金属辅基的称（Mn-S0D)，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和 原核细胞内；第三种是含铁（Fe)金属辅基的称（Fe-SOD)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。 超氧化物歧化酶能够清除超氧化物，保护细胞免受氧化损伤。超氧化物与非自由 基的反应是自旋禁阻的。在生物学系统中，这就意味着它主要是与自身（歧化）或另一个 生物学自由基（如一氧化氮）反应。超氧化物阴离子自由基（〇 20能够较快地（在pH= 7 时，反应速度为歧化为02和过氧化氢（H202)。但超氧化物能够与特定的分子（如 N0自由基）以更快的速度反应，生成过氧亚硝酸根离子（0 =N-0-CT)，因此超氧化物歧化 酶的催化作用就显得尤为重要。而且，超氧化物的歧化反应与其初始浓度的平方相关，因此 虽然高浓度的超氧化物半衰期很短（比如〇.ImM浓度下为〇. 05秒），但低浓度的超氧化物 的半衰期相当长（〇.InM浓度下可达14小时）。相比较而言，超氧化物歧化酶催化的歧化反 应对于超氧化物初始浓度只是一级反应，并且在所有已知酶中具有最快的转换数（与底物 反应速率）(LoefflerPetridesHeinrich.Biochemie&Pathobiochemie. 8th Edition. 2007. 123.)，因此反应速率的限制只是在于酶和超氧化物分子间的碰撞频率，即 反应速率是扩散限制性的。 超氧化物是细胞中主要的活性氧之一，因此超氧化物歧化酶发挥了关键的抗 氧化剂的作用。超氧化物歧化酶具有重要的生理学作用，基因工程改造后的缺乏该 酶的小鼠会患上严重的疾病。例如，缺乏S0D2的小鼠在出生后数天死于严重的氧化 应急(Li,etal. ,Y.Dilatedcardiomyopathyandneonatallethalityinmutant micelackingmanganesesuperoxidedismutase.Nat.Genet. 1995,11:376 - 381. doi: 10. 1038/ngl295-376.);缺乏S0D1的小鼠具有广泛的病理特征，包括肝细胞 癌(hepatocellularcarcinoma) (Elchuri,etal.,S.CuZnSODdeficiencyleadsto persistentandwidespreadoxidativedamageandhepatocarcinogenesislaterin life. ?Oncogene. 2005, 24:367 - 380.doi: 10. 1038/sj.one. 1208207.)、与年纪相关的肌肉 的质量力口速减少（Muller，etal.，F.L.AbsenceofCuZnsuperoxidedismutaseleads toelevatedoxidativestress,mutagenesisandaccelerationofage-dependent skeletalmuscleatrophy.FreeRadic.Biol.Med. 2006, 40:1993 - 2004.doi:10. 1016/j.freeradbiomed.2006.01.036.)、白内障提早发生以及寿命减少；缺乏S0D3的小鼠不 表现出任何明显的缺陷并具有正常的寿命，然而它们更易于发生高氧损伤。敲除任何 一种超氧化物歧化酶的小鼠更易于死于超氧化物生产的药剂，如百草枯（paraquat)和 舌夂草快(diquat) (Sentman,etal. ,M.L.Phenotypesofmicelackingextracellular superoxidedismutaseandcopper-andzinc-containingsuperoxidedismutase. J.Biol.Chem. 2006, 281:6904 - 6909.doi:10. 1074/jbc.M510764200.)〇 缺少S0D1的果蝇具有显著缩短的寿命，而缺少S0D2的果蝇则在出生前就死去。在 线虫线虫中敲除S0D不导致严重的生理学紊乱。S0D1的敲除或缺失突变对于酿酒酵母在 无氧环境生长非常有害，并导致后二峰生长期（P〇st-diauxiclifespan)的显著缩短；而 S0D2的敲除或缺失突变则会引起生长抑制并同样减少后二峰生长期。 冬虫夏草（cordycepssinensis)别名虫草，冬虫草，中华虫草，是由肉座菌目蛇形 虫草科蛇形虫草属的冬虫夏草菌寄生于高山草甸土中的蝠蛾幼虫，使幼虫身躯僵化。并在 适宜条件下，夏季由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成，即冬虫夏草菌的子实体与僵虫 菌核（幼虫尸体）构成的复合体。主要活性成分是虫草素，其有调节免疫系统功能、抗肿 瘤、抗疲劳、补肺益肾，止血化痰，秘精益气等多种功效。食用方法有打粉、泡酒、泡水等。冬 虫夏草主要产于中国大陆青海、西藏、四川、云南、甘肃和贵州等省及自治区的高寒地带和 雪山草原。冬虫夏草也含有S0D，但含量极低。为了获得冬虫夏草S0D，我们利用现代基因 工程技术，尝试了表达冬虫夏草S0D蛋白工程菌及其载体，本专利技术系统优化、改变了获得冬 虫夏草S0D的大肠杆菌工程细胞的方法，利用大肠杆菌基因表达的分泌肽段与S0D融合表 达获得了更为满意的结果，并通过发酵工艺的改进，同时简便纯化工艺，获得高表达、高活 性和高得率、极具产业化价值的一种铜锌型rcSOD生产方法。
技术实现思路
基于现有技术的缺欠，本专利技术的目的是提供编码上述信号肽的核苷酸序列、含有 该信号肽核苷酸序列和冬虫夏草S0D核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从 该工程细胞纯化rcSOD的方法。 本专利技术的专利技术人惊奇地发现，在表达如SEQIDN0 :3所示的冬虫夏草S0D核苷酸 序列前，加入如SEQIDN0 :1所示的信号肽核苷酸序列，可以意外地获得高融合表达的冬虫 夏草S0D的载体，且使用该载体表达的S0D易于纯化，纯度高、收量大，活性高。 在本专利技术的又一个方面，提供了一种在编码冬虫夏草超氧化物歧化酶的核苷酸序 列前加入一个能使冬虫夏草超氧化物歧化酶表达后分泌到细胞壁与原生质膜间隙的分泌 肽段核酸序列，所述的核苷酸序列SEQIDN0 :1能够编码SEQIDN0 :2所示的氨基酸序列， 而且所述核苷酸序列SEQIDNO: 1与冬虫夏草超氧化物歧化酶编码区序列SEQIDN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组冬虫夏草超氧化物歧化酶,其特征在于，所述冬虫夏草超氧化物歧化酶包含任一如下氨基酸序列：a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；和/或b)SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；或c)SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。
【技术特征摘要】
2014.06.18 CN 201410273815.71. 一种重组冬虫夏草超氧化物歧化酶，其特征在于，所述冬虫夏草超氧化物歧化酶包 含任一如下氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。2. 分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子包含任一如下核苷酸序列： a) 编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 编码SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。3. -种重组冬虫夏草超氧化物歧化酶，其特征在于，所述冬虫夏草超氧化物歧化酶通 过表达任一以下所示的核苷酸序列而获得： a) 编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 编码SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。4. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有任一如下核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。5. 如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET22b。6. -种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是通过转化权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘爽，邓小霞，孙晓悦，庞玉，王子华，
申请(专利权)人：吉林省金梓源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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