一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用，以羽叶三七的cDNA文库为模版，引物P1:5'ATGGAACTCGGGAGGAGTT3'；引物P2:5'TTACATTTTTTTAGTAATGG3'；进行PCR扩增，可获得羽叶三七鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到羽叶三七中，可提高羽叶三七中总皂苷的含量，为羽叶三七总皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用，以羽叶三七的cDNA文库为模版，引物P1:5'ATGGAACTCGGGAGGAGTT3'；引物P2:5'TTACATTTTTTTAGTAATGG3'；进行PCR扩增，可获得羽叶三七鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到羽叶三七中，可提高羽叶三七中总皂苷的含量，为羽叶三七总皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。【专利说明】—种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用
本专利技术属于生物
，主要涉及羽叶三七中鲨烯环氧酶基因的克隆和应用，
技术介绍
羽叶三七(Panaxjaponicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu etΚ.Μ.Feng)属于五加科人参属(Panax L.)植物,是传统的名贵药材之一,具有较高的药用价值，如清热解毒、顺气健胃、活血祛疲、滋补强壮等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。 羽叶三七是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值，目前中国羽叶三七的野生资源近于濒危，通过研究羽叶三七中活性成分三萜皂苷类化合物的生物合成途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。 S烯环氧酶(Squalene epoxidase, SQE)基因在三職类阜苷的生物合成途径中起着重要的作用。SQE通过在C-C之间插入I个氧原子催化角鲨烯生成中间体单氧态角鲨烯，此中间体在强光和紫外线的作用下可生成2，3_氧化角鲨烯。而2，3-氧化角鲨烯是三萜类化合物——植物留醇、达玛烯二醇、环阿乔醇的前体，其合成直接关系羽叶三七中三萜类皂苷的含量，目前，SQE被公认为是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶之一。 本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行羽叶三七全株的转录组测序及Denovo拼接。分析找到羽叶三七中编码鲨烯环氧酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能。为羽叶三七三萜皂苷化合物的生物合成提供理论基础。 在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其氨基酸序列。此基因编码的鲨烯环氧酶在羽叶三七中三萜皂苷化合物的生物合成的过程中具有重要的作用，本专利认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来研究羽叶三七中三萜皂苷化合物生物合成的关键点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因，其序列为SEQ IDN 0.1所示。该基因被公认为是人参属植物活性成分三萜皂苷合成的关键基因，进而为人参属植物中三萜皂苷含量的提高提供技术手段。 本专利技术的另一个目的是提供羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示， 本专利技术的最后一个目的在于提供羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因在在提高羽叶三七中三萜皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到羽叶三七中，可提高羽叶三七中三萜皂苷的含量。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施: 一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因(以下称为PjSQE基因)，其制备方法如下: 以羽叶三七的cDNA文库为模版，引物Pl: 5’ ATGGAACTCGGGAGGAGTT3，;引物P2:5’ TTACATTTTTTTAGTAATGG3’ ；PCR 反应条件:94°C 预变性 5min ;94°C变性 lmin, 52.6°C退火50s, 72°C延伸lmin, 30个循环；72°C延伸1min0 最终获得了 PjSQE基因，其序列为SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示。 一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因在提高三萜类皂苷的含量中的应用，其应用过程如下: 将羽叶三七鲨烯环氧酶蛋白质(SEQ ID N0.2所示)对应的PjSQE基因(优选SEQI D N0.1所示的核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，可获得高三萜皂苷含量的的转基因植株。 本专利技术的所要保护的内容还包括: 编码SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。 含有本专利技术的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本专利技术的保护范围，包括但不限于pC AMBIA 系列载体，pRTL。 含有本专利技术的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、羽叶三七细胞或羽叶三七发根细胞。 本专利技术的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体，包括但不限于烟草，拟南芥，酵母羽叶三七发根。 本专利技术中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 利用本专利技术的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点: 本专利技术所提供的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因是首次从羽叶三七植物中克隆制备所得，利用本专利技术的技术可以对羽叶三七等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的三萜皂苷化合物的含量。羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因可参与羽叶三七三萜皂苷化合物的生物合成，因此本申请为羽叶三七三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。 本专利技术利用转基因技术得到了三萜皂苷含量增加的高产株，为三萜皂苷的的工业化生产提供了技术支撑。 【专利附图】【附图说明】 : 图1为羽叶三七总RNA电泳图。 图2为PjSQE功能域预测分析。 图3为PjSQE系统进化树。 图4为表达载体pYEUra3_PjSQE构建示意图。 图5为酶促反应产物薄层色谱分析。 【具体实施方式】 本专利技术所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。 实施例1: 羽叶三七转录组测序及数据分析 1、样品采集 羽叶三七(Panaxjaponicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu etΚ.M.Feng)植株来源于湖北恩施，分别取根茎，叶，花，果实置液氮中速冻后，在_80°C冰箱中冷冻保存备用。 2、羽叶三七总RNA的分离和检测 对_80°C保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张绍鹏，陈平，赵小龙，汪琪，朱闻君，伍翀，王如峰，邓琛，郑用琏，
申请(专利权)人：张绍鹏，陈平，赵小龙，汪琪，朱闻君，伍翀，王如峰，邓琛，郑用琏，霍梦蕊，
类型：发明
国别省市：湖北;42