一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用，利用正向引物P1:5'ATGGATTTAGGGGTTCACT3'；反向引物P2:5'TCAGAATTTGATGTCATCTGCAG3'以竹节参cDNA文库为模板进行扩增，可获得竹节参鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，可提高竹节参中总皂苷的含量，为竹节参三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用，利用正向引物Pl:5’ATGGATTTAGGGGTTCACT3’；反向引物P2:5’TCAGMTTTGATGTCATCTGCAG3’以竹节参cDNA文库为模板进行扩增，可获得竹节参鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQIDN0.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，可提高竹节参中总皂苷的含量，为竹节参三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。【专利说明】一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用
本专利技术属于生物
，主要涉及竹节参中S烯环氧酶（Squalene epoxidase) 基因的克隆和应用，
技术介绍
竹节参（Panax japonicus C. A. Mey)属于五加科人参属（Panax L.)植物是传统的 名贵中药材之一，具有较高的药用价值，如增强人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保 护心肌等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主， 同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。 竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值，目前中国 竹节参的野生资源近于濒危，人工栽培药材生长周期长，造成目前市场供不应求的现状。通 过研究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键 酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调 控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。 S烯环氧酶（Squalene epoxidase，SQE)基因在三廠类阜苷的生物合成途径中起 着重要的作用。SQE通过在C-C之间插入1个氧原子催化角鲨烯生成中间体单氧态角鲨烯， 此中间体在强光和紫外线的作用下可生成2, 3-氧化角鲨烯。而2, 3-氧化角鲨烯是三萜类 化合物--植物留醇、达玛烯二醇、环阿乔醇的前体，其合成直接关系竹节参中三萜类皂苷 的含量，目前，SQE被公认为是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶之一。 本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行竹节参全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到竹节参中编码鲨烯环氧酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功 能，为竹节参三萜皂苷化合物的生物合成提供理论基础。 在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参鲨烯 环氧酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中三萜皂苷化合物的生物合成的过 程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控竹节参 中三萜皂苷化合物生物合成的关键点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。该基因是人参属植物活性成分三萜皂苷合成的关键基因，进而为人参属植物中 三萜皂苷含量的提高提供技术手段。 本专利技术的第二个目的是提供一种竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因编码的蛋白质， 其序列为SEQ ID NO. 2所示。 本专利技术的最后一个目在于提供一种竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因在提高竹节 参中总皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，可提高竹节参 中总皂苷的含量。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施： 一种竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因（以下称为PJSQE基因），其制备方法如下： 利用正向引物 Pl: 5' ATGGATTTAGGGGTTCACT3' ；反向引物 P2:5' TCAGAATTTGATGT CATCTGCAG3'以竹节参cDNA文库为模板进行扩增，PCR反应程序为94°C预变性5min，94°C 变性4〇8,541：退火11^11，721：延伸9〇8,40个循环后，721：延伸1〇1^11。 最终获得了 PJSQE基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO. 2 所示。 一种竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因或竹节参鲨烯环氧酶在提高竹节参总皂苷 含量中的应用，其应用过程如下： 将竹节参竹节参鲨烯环氧酶蛋白质（SEQ ID NO. 2所示）对应的PJSQE基因（优 选S EQ ID NO. 1所示的核苷酸序列）通过农杆菌介导的遗传转化转入竹节参，可获得高总 皂苷含量的的转基因植株。 本专利技术的所要保护的内容还包括： 编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。 含有本专利技术的竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因全序列或其ORF序列的重组载体， 如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本专利技术的保护范围，包括但不限于一些 常用的植物表达载体，例如ΦΒΙ121，pCAMBIA1301。 含有本专利技术的竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞， 如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。包括但不限于烟草细胞大肠 杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参细胞或竹节参发根细胞。 本专利技术的竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植 物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转 基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的竹节参鲨烯环氧酶 (PJSQE)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体。包括但不限于烟草、酵母、拟 南芥、竹节参发根。 本专利技术中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆 菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 利用本专利技术的竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与竹 节参鲨烯环氧酶（PJSQE)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点： 本专利技术所提供的竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基因是首次从竹节参植物中克隆制 备所得，利用本专利技术的技术可以对竹节参等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改 造，通过转基因来提高植物体内的三萜皂苷化合物的含量。竹节参鲨烯环氧酶（PJSQE)基 因可参与竹节参三萜皂苷化合物的生物合成，因此本专利为竹节参三萜皂苷生物合成的进 一步研究和工业化生产提供理论依据。 本专利技术利用转基因技术得到了总皂苷含量增加的高产株，为皂苷的的工业化生产 提供了技术支撑。 【专利附图】【附图说明】 图1为竹节参总RNA电泳图。 图2为PJSQE功能域预测分析。 图3为PJSQE系统进化树。 图4为表达载体pYEUra3_PJSQE构建示意图。 图5为酶促反应产物薄层色谱分析示意图。 【具体实施方式】 本专利技术所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明， 均购自生化商店。 实施例1 : 竹节参转录组测序及数据分析 1、样品采集 竹节参植株来源于湖北恩施Panax japonicus C. A. Mey,分别取根莖、叶、花，果实 置液氮中速冻后，在_80°C冰箱中冷冻保存备用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张绍鹏，陈平，杨涛，朱闻君，宋佳，孙巧，伍翀，王如峰，邓琛，陈超，郑用琏，
申请(专利权)人：张绍鹏，陈平，杨涛，朱闻君，宋佳，孙巧，伍翀，王如峰，邓琛，陈超，郑用琏，
类型：发明
国别省市：湖北;42