本发明专利技术公开一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白及其编码基因克隆方法与序列。本发明专利技术通过RACE方法克隆得到乌拉特柄扁桃SOD基因全长，对其编码蛋白进行分析，从而探讨该基因在提高转基因植物抗氧化、盐胁迫等方面的作用。乌拉特柄扁桃SOD基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗传转化对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。本发明专利技术获取的乌拉特柄扁桃SOD基因将在乌拉特柄扁桃抗氧化机制研究、蔷薇科植物抗逆性中发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
乌拉特柄扁桃SOD蛋白基因序列及应用
本专利技术涉及一种乌拉特柄扁桃SOD基因及其编码蛋白序列、基因克隆方法及应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，有效地防止它们对生物体的损害，几乎参与了生物体对各种逆境的生理生化反应，是生物体内一种很重要的抗氧化酶类。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中。根据SOD结合的金属离子的不同，可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD3种类型。目前，国内外学者已经先后从白杨、甘薯、木薯、桃等等作物中克隆出该基因的cDNA全长序列或片段序列。乌拉特柄扁桃(Prunuspedunculatacv.Wulate)是蔷薇科李属灌木，利用野生柄扁桃种子，经多年栽培选育而成。抗旱、耐寒、耐瘠薄、抗风沙、耐沙埋、抗损伤性强。返青早、枯黄晚，适口性较好。适宜内蒙古自治区中西部地区种植。目前为止，从乌拉特柄扁桃中获得SOD基因序列尚未报道。通过RACE方法克隆得到乌拉特柄扁桃SOD基因全长，对其编码蛋白进行分析，从而探讨该基因在提高转基因植物抗氧化、盐胁迫等方面的作用。乌拉特柄扁桃SOD基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗传转化对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白、基因序列及应用。本专利技术所提供的SOD蛋白，来源于乌拉特柄扁桃(Prunuspedunculatacv.Wulate)，是具有序列表中SEQIDNo：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQIDNo：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNo：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNo：2衍生的蛋白质。乌拉特柄扁桃SOD的基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQIDNo：1；2)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中的SEQIDNo：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中SEQIDNo：1由1207个碱基组成，其开放阅读框为自5′端第76到第789位碱基；序列表中SEQIDNo：2由237个氨基酸残基组成。含有本专利技术基因的表达载体及细胞系均属于本专利技术的保护范围。扩增乌拉特柄扁桃SOD基因中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的SOD基因将为乌拉特柄扁桃生长发育过程研究，对植物生长发育的理论研究打下坚实的基础，以及SOD基因功能研究具有重要意义。附图说明图1：乌拉特柄扁桃SOD基因3′端扩增产物凝胶电泳图谱图2：乌拉特柄扁桃SOD基因5′端扩增产物凝胶电泳图谱图3：乌拉特柄扁桃SOD全长基因扩增产物凝胶电泳图谱图4：乌拉特柄扁桃SOD蛋白与其它植物SOD蛋白序列比对图5：乌拉特柄扁桃SOD蛋白与其它植物SOD蛋白进化树分析图6：转基因与野生型拟南芥SOD活性检测图7：离体叶片H2O2处理具体实施方式实施例1、乌拉特柄扁桃SOD蛋白编码基因的获得1.1RNA的提取RNA提取参照张劲松等人的方法进行(张劲松，等.中国科学，B辑，1995，25(5)：659～669)，乌拉特柄扁桃根在液氮中研碎，悬于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/L十二烷基肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0.1mol/Lβ-巯基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/LLiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸钠/乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，贮存于-20℃(备用，用0.8％的琼脂糖检测RNA的完整性。1.23′RACE序列获得：利用NCBI网站上公布的桃SOD基因序列，设计一条引物SP1：5′-GGAGCATGCGTACTACTTACA-3′，用于3′RACEPCR扩增。按照SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech，Cat.no.K1811-1)的方法作RT-PCR。3′端的扩增的循环参数为：94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，35个循环。PCR产物经凝胶电泳分析得知，获得约为500-bp的DNA条带(图1)，产物回收纯化，连接，转化，通过测序获得了534-bp的DNA片段，3′端序列为SEQIDNo：4。1.35′RACE序列获得：利用3′RACE测序结果，设计一条引物SP2：5′-CGCTGGCATACTTCCAGTTGATT-3′,用于5′RACEPCR扩增。按照SMARTRACEcDNAAmplificationKit的方法作RT-PCR。5′端的扩增循环参数为：94℃变性5s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，70℃退火10s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，25个循环。PCR产物经凝胶电泳分析得知，获得约为750-bp的DNA条带(图2)，产物回收纯化，连接，转化，通过测序获得了763-bp的DNA片段，5′端序列为SEQIDNo：5.1.4该基因编码区序列的获得以测序的3′RACE和5′RACE片段序列为基础，设计一对引物SOD-1和SOD-2用于扩增完整编码区序列。SOD-1：5′-GTACATCTCCTCCCAGCAACACACT-3′SOD-2：5′-GGCCTCATTTGTCACACAGATCATT-3′扩增循环参数为：94℃变性30s，55℃延伸30s，72℃延伸1min，30个循环。PCR产物经凝胶电泳分析得知，获得约为750bp的DNA条带(图3)，产物回收纯化，连接，转化，通过测序获得了763bp的DNA片段，借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完整序列，该序列全长为1207bp，具有SEQIDNo：1的DNA序列，76-786bp为其完整编码区域，具有SEQIDNo：3的DNA序列编码的蛋白含有237个氨基酸残基，具有SEQIDNo：2的氨基酸残基序列。实施例2、乌拉特柄扁桃SOD蛋白的序列及功能分析实验2.2生物信息学分析：用BLAST和DNAMAN软件对乌拉特柄扁桃SOD蛋白的序列进行比较分析，结果表明乌拉特柄扁桃SOD与桃、橡胶树及野草莓的SOD具有极大的同源性(如图4，图5所示)。2.2转基因分析：2.2.1表达载体的构建设计引物1对引物用于构建植物表达载体SOD-f：5′-cccTCTAGAATGGCTCTTCGAGCTCTCGTGGCC-3′SOD-r：5′-cccGGATCCTCAAGGGCTTTCTTTCTCGTACAC-3′(其中下划线部分分别表示XbaI，BamHI酶切位点)。植物表达载体的构建过程：提取乌拉特柄扁桃叶片的总RNA，用oligo(dT)18作反转录。反转录产物用引物SOD-f，SOD-r进行PCR，得到含有完整开放阅读框的DNA片段，连接到pMD19-T载体上，获得重组克隆载体，命名为pMD-SOD。转化大肠杆菌，并送到生物公司测序。对于含有正确序列的菌株，摇菌提取质粒，用XbaI和BamHI分别双酶切pMD-SOD和pBI121载体，回收、纯化酶切本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白，是具有序列表中SEQ ID No：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白，是具有序列表中SEQIDNo：2氨基酸序列的蛋白质。2.乌拉特柄扁桃SOD蛋白的编码基因，其是编码SEQIDNo：2所示的氨基酸序列的多核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙杰，刘永志，晁跃辉，张爱东，羿静，李敬忠，王凤武，青格乐，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
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