本发明专利技术公开了一种表达人骨形态发生蛋白的方法及其专用表达载体。本发明专利技术所提供的人骨形态发生蛋白植物表达载体，是在花椰菜花叶病毒的３５Ｓ启动子下游插入有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因（并去掉５′端１２个氨基酸的肝素结合区）的ｐＢＩ１２１质粒。本发明专利技术所提供的表达人骨形态发生蛋白的方法，是将上述人骨形态发生蛋白的植物表达载体导入烟草中得到转基因烟草，培育转基因烟草细胞，表达得到人骨形态发生蛋白。该方法可表达人骨形态发生蛋白占全蛋白的０．０２％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表达人骨形态发生蛋白的方法及其专用表达载体。
技术介绍
组织器官工程是利用细胞的培养技术在体外人工控制细胞分化、增殖并生长成需要的组织，用来修复由于意外损伤等引起的功能丧失的体内组织。在细胞增殖，生长和定向分化过程中，需要多种生长因子对其进行调控。人的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)对骨器官的形成起重要的调节作用。BMP属于TGF-β超家族(Urist，M.R.，Lietze，A.，Mizutani，H.，Takagi，K.，Triffitt，J.T.，Amstutz，J.，DeLange，R.，Termine，J.，Finerman，G.A.，(1982).Abovine low molecular weight bone morphogenetic protein(BMP)fraction.Clin.Orthop.162，219-232)，目前已发现了13种BMP(BMP-1～BMP-13)，诱骨活性最强的是BMP2。BMP2首先由Wozney(Wozney，J.M.，Rosen，V.，Celeste，A.J.，Mitsock，L.M.，Whitters，M.J.，Kriz，R.，Hewick，R.，Wang，E.A.(1988).Novelregulators of bone formationMolecular clones and activities.Science 242.1528-1534)从人的cDNA文库中克隆出来。BMP2的生物活性是诱导骨形成，促进骨损伤的修复，诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化，同时，对胚胎肢芽和心、眼、肾、神经等组织器官的发育亦有重要调节作用。BMP2的独特的生物学活性使其不仅在组织器官工程研究领域中具有不可替代的作用，而且对骨折、骨缺损、骨质疏松、牙周病等多种骨性疾病的治疗具有巨大的应用价值。BMP2通常表达量极低，虽然采用生物化学方法可从各种骨组织中提取天然的BMP2，但产量低和动物蛋白抗原性等的原因使其远远不能满足组织器官工程研究的需要和临床的要求。运用基因工程的方法可获得足够量的人BMP2蛋白。骨形态发生蛋白-2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成的成熟肽，并进行糖基化修饰方可成为成熟的人BMP2。目前人BMP基因在COS、CHO、昆虫等真核细胞和大肠杆菌中得到表达(Hammonds，R.G.Jr.，Schwall，R.，Dudley，A.，Berkemeier，L.，Lai，C.，Lee，J.，Cunningham，N.，Reddi，A.H.，Wood，W.I.，Mason，A.J.(1991)，Bone-inducing activity of mature BMP-2b produced froma hybrid BMP-2a/2b precursor.Mol.Endocrinol.Jan；5(1)，149-155；Ishida，N.，Tsujimoto，M.，Kanaya，T.，Shimamura，A.，Tsuruoka，N.，Kodama，S.，Katayama，T.，Oikawa，S.，Matsui，M.，Nakanishi，T.，et al.(1994)，Expressionand characterization of human bone morphogenetic protein-2 in silkworm larvaeinfected with recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus.J.Biochem(Tokyo).Feb；115(2)279-85)，但产量低、成本高或活性低等缺点制约了其应用。虽然，细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞和转基因动物都可以作为表达系统生产药用蛋白，但植物作为生产药用蛋白的生物反应器具有很多潜在的优势1)能对真核生物蛋白进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化，而细菌在发酵过程中常常产生不溶性聚合物，降低了蛋白活性，提高成产成本；2)植物中不含有潜在的人类病原，其生产系统较为安全，细菌本身是人类的病原体，而动物病毒对人类有潜在危害；3)易于扩大生产和储藏运输，降低生产成本；4)通过有效手段可以简化蛋白提取和纯化的环节；5)很多人或动物的基因在原生物体内受到细胞整体调控的影响表达量极低，即使通过基因工程的方法也很难在动物细胞或体内得到高效表达，而这些蛋白的积累又可能伤害动物或动物细胞，用转基因植物作为表达系统有望克服这一缺点。近年来，随着植物转基因技术的不断发展和成熟，越来越多的疫苗基因、抗体基因、和药用蛋白基因转入到不同的植物中并进行了表达，如HBsAg基因转入烟草中并得到表达(Mason，H.S.，Ball，J.M.，Shi，J.J.，Jiang，X.，Estes，M.K.，and Arntzen，C.J.(1996).Expression of Norwalk virus capsid protein intransgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice.Proc.Natl.Assoc.Sci.93，5335-5340)；人的β-干扰素、血红素、血清白蛋白都在烟草中得到表达(Cramer，C.，Boothe，J.G.，Oishi，K.K.(1999).Transgenic plantsfor therapeutic proteinslinking upstream and downstream technologies.Current Topics in Microbiology and Immunology.240，95-118)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种可在烟草中表达人骨形态发生蛋白的植物表达载体。本专利技术所提供的人骨形态发生蛋白植物表达载体，是在花椰菜花叶病毒的35S启动子下游插入有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的pBI121质粒。pBI121质粒可购自CLONTECH公司。人骨形态发生蛋白的成熟肽具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；所述人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因可为具有序列表中序列2的核苷酸序列。序列表中的序列1由114个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)的第1-12位氨基酸残基为肝素结合区(Ruppert，R.，Hoffmann，E.，and Sebald，W.(1996).Humanbone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifiesits biological activity.Eur.J.biochem.237，295-302)。序列表中的序列2由345个碱基组成，自5′端的第1-36位碱基为肝素结合区的编码序列。为了提高表达后的BMP2的活性，所述人骨形态发生蛋白的成熟肽的编码基因中缺失人骨形态发生蛋白的成熟肽的N端12个氨基酸的肝素结合区的编码序列，得到具有序列2的自5’端第37到第345位碱基的人骨形态本文档来自技高网...
【技术保护点】
人骨形态发生蛋白植物表达载体，是在花椰菜花叶病毒的３５Ｓ启动子下游插入有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的ｐＢＩ１２１质粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：索广力，陈冰，薛勇彪，戴建武，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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