制备重组人骨形态发生蛋白-7成熟肽二聚体的方法技术

本发明专利技术提供的制备重组人骨形态发生蛋白－７成熟肽二聚体的方法包括以下步骤：１）编码ｒｈＢＭＰ－７成熟肽的核甘酸序列ＳＥＱＩＤＮＯ．１，它具有ＳＥＱＩＤＮＯ．２蛋白质序列；２）构建含ＢＭＰ－７基因的表达载体；３）将步骤２）中的表达载体转入宿主细胞，形成能产生人ＢＭＰ－７蛋白质的转化细胞，并对其进行检测；４）培养步骤３）中的转化子细胞；５）用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组蛋白质，将单链ＢＭＰ－７复性、分离、纯化得到有生物活性的二聚体。用本发明专利技术方法制备重组人骨形态发生蛋白－７成熟肽二聚体，可大大降低成本，提高产量，操作简便。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，具体说，涉及在原核细胞，尤其是在大肠杆菌中大量制备，并得到有高度生物学活性的重组人骨形态发生蛋白-7成熟肽二聚体的方法
技术介绍
骨科疾患是困扰人类的常见病，无论在平时的交通或工伤事故，还是在战伤事件中都占有很大比例。人类社会的老龄化，使得防治骨质疏松等因素造成的骨科疾病成为受到各方面严重关注的问题。而牙病更是贯穿人的一生的疾患，特别是经历岁月的研磨，牙本质缺损带来的苦痛，令人心悸。所以，在医务工作者和制药行业的迫切期待下，生物技术工作者已经在用新技术和新方法研制治疗骨科与齿科疾病的药物。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是具有异位成骨作用的一种生长因子。自1965年美国的Urist发现BMP以来，迄今已经成功地克隆了19种左右的人BMP基因，为研制新的骨科治疗药物创造了条件。其中，BMP-7不仅有促使骨骼生长的作用，还有促进牙本质生长的功能。因此，它在骨科和牙科疾病的治疗中有特殊的地位。大量研究证明，在人细胞中BMP-7是以由431个氨基酸残基组成的前肽原形式存在的。在其成熟过程中，这个前体分子被真核细胞的特殊裂解酶剪切为292个氨基酸残基的前原区和139个氨基酸残基的成熟肽片段。研究还发现，包括BMP-7在内的BMP蛋白必须形成同源或异源二聚体，并且只有它们的二聚体才有活性，单体是没有生物学活性的。只有真核细胞才含有Furin酶，所以只有将全长的BMP-7基因转染真核细胞，才能产生成熟的BMP-7蛋白质。迄今为止，用生物技术生产人BMP-7只有在真核细胞系统中才获得成功，使得制备这个产品的成本很高，产量也受到限制。如用原核生物系统制备出有生物活性的人BMP-7，就能大大地降低成本，简便操作过程和提高产量，这是一个极其吸引人的研究课题。虽然早就有人，如我国著名的生物学家侯云德先生等，首先在大肠杆菌中表达了人BMP-7的成熟肽，但是，所得到的是单体，而表现不出生物学活性。所以，只有用大肠杆菌产生出有生物活性的BMP-7成熟肽二聚体，才能实现大规模生产有治疗作用的价廉的人BMP-7，满足临床治疗的需要。
技术实现思路
本专利技术是要提供一种用大肠杆菌生产的有生物活性的重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽二聚体的方法。本专利技术提供的方法包括以下步骤1)编码rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白质序列；2)构建含BMP-7基因的表达载体；3)将步骤2)中的表达载体转入宿主细胞，形成能产生人BMP-7蛋白质的转化细胞，并对其进行检测；4)培养步骤3)中的转化子细胞；5)用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组蛋白质，将单链BMP-7复性、分离、纯化得到有生物活性的二聚体。本专利技术编码rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列详见SEQ ID NO.1，它具有SEQID NO.2蛋白质序列对于编码rhBMP-7成熟肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在第一个氨基酸密码子之前加上了起始密码子ATG和限制性内切酶的识别位点，在最后一个氨基酸之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点，将编码rhBMP-7成熟肽的核苷酸序列中真核细胞喜好，而大肠杆菌完全不用或极少使用的密码子改变为大肠杆菌喜好的密码子，本专利技术中，加在合成基因首、末两端的限制性内切酶识别位点可以是任意的II类限制性内切酶识别位点。本专利技术中，可选用与BMP-7基因上加的识别位点具有相同的限制性内切酶识别位点的市售载体系统。本专利技术中，术语“宿主细胞”为原核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌，枯草杆菌等。本专利技术中，用化学试剂裂解细胞的裂解液是5-7mol/L的盐酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9。本专利技术中将单链BMP-7复性所用的溶液为氧化还原剂——0.1-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽；助溶剂——0.1-2mol/L的NaCl；金属螯合剂——1-10mmol/L的EDTA和其他添加剂——0.5-5％左右的甘油，聚乙二醇等。用本专利技术方法制备重组人骨形态发生蛋白-7成熟肽二聚体，可大大降低成本，提高产量，操作简便。附图说明图1为含有合成的人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因的，IPTG诱导表达型载体(pET 11b-BMP-7)图2为pET 11b-BMP-7的NdeI和BamHI两个限制性内切酶酶切鉴定，图中M为分子量标准，1-10为不同的样品；A、B分别为500bp、250bp分子量大小，C为载体片段(5.7Kb)，D为插入的基因片段(423bp)图3为重组人骨形态发生蛋白-7单体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中M为分子量标准(从上到下依次为97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)，箭头所指处为BMP-7单体。C为未经IPTG诱导的对照样品，1-5为经IPTG诱导的样品。图4为重组人骨形态发生蛋白-7二聚体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中5为分子量标准(从上到下依次为97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)。1为纯化后的BMP-7二聚体，2为BMP-7包涵体，3为诱导表达的BMP-7全菌蛋白，4为没有插入目的基因的宿主菌蛋白，5为蛋白分子量标准，6为BMP-7复性蛋白，A为二体，B为单体。图5为在两只小鼠肌袋内植入重组人骨形态发生蛋白-7二聚体后形成的新骨。具体实施例方式以下具体实例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术范围。本专利技术的制备重组人骨形态发生蛋白-7成熟肽二聚体的方法，包括1)编码rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白质序列；编码rhBMP-7成熟肽核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在第一个密码子之前加上了起始密码子ATG和限制性内切酶的识别位点，在最后一个氨基酸密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点；将编码rhBMP-7成熟肽核苷酸序列中真核细胞喜好，而大肠杆菌完全不用或极少使用的密码子改变为大肠杆菌喜好的密码子，如脯氨酸的CCC；精氨酸的AGA，AGG和CGG；甘氨酸的GGA和GGG等加以改变，2)构建含BMP-7基因的表达载体；用表达载体pET-11b，将合成的BMP-7基因，(起始端含Nde I酶切位点，终止端含Bam HI酶切位点)，与pET-11b分别经Nde I和Bam HI双酶切处理，酶切条件为37℃温育3小时。然后将酶切产物用1～2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳20分钟，电压100伏。用Bio101凝胶回收DNA的试剂盒回收上述两个DNA片段。其过程为用干净手术刀切下目的片段，分别放入两个1.5毫升离心管中。加200～500微升Nal，置于温水(45～55℃)中至胶完全融化。将玻璃珠(Glassmilk，为Bi0101纯化试剂盒中的商品)涡旋1分钟，各取7微升加入上述两管，放置5分钟，每1-2分钟混匀一次。将两管在13000g下离心5秒。去上清，再将沉淀物重悬浮于500微升New Wash液。而后又在13000g下离心5秒。再去上清。重复上述步骤二次(重复悬浮，离心三次)。最后一次小心吸净上清。在空气中干燥5～10分钟。将沉淀用17～50微升TE溶解，置于37℃水浴放置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备重组人骨形态发生蛋白－７成熟肽二聚体的方法，其特征是该方法包括以下步骤：１）编码ｒｈＢＭＰ－７成熟肽的核甘酸序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１，它具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２蛋白质序列；２）构建含ＢＭＰ－７基因的表达载体；３）将步 骤２）中的表达载体转入宿主细胞，形成能产生人ＢＭＰ－７蛋白质的转化细胞，并对其进行检测；４）培养步骤３）中的转化子细胞；５）用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组蛋白质，将单链ＢＭＰ－７复性、分离、纯化得到有生物活性的二聚体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐放，郑仲承，
申请(专利权)人：杭州华东医药集团公司基因技术研究所，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]