本发明专利技术涉及一个调控未折叠蛋白质反应（ＵＰＲ）的多形汉森酵母新基因和使用该基因增强分泌表达重组蛋白质效率的方法。更具体地说，通过识别、修饰和优化ＨｐＨＡＣｌ基因来增强分泌表达重组蛋白质效率的方法，该基因编码Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ里未折叠蛋白质反应机制的关键调节因子，该调控机制由此基因介导。依照本发明专利技术建立的Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ的分泌表达体系可被用作大量生产有工业和医疗用途的分泌蛋白质，从而实现低成本生产大量蛋白质。相应地，本方法被用作生产有工业和医疗用途的蛋白质，以便减低病人的经济负担，有助于改善全人类的社会福利。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一个来源于多形汉森酵母CK /w(yww;^fl)能调控未折叠蛋白质反应 (UPR)的新基因和使用该基因提高重组蛋白质分泌表达效率的方法，特别是通过识别、 修饰和优化HpHACl基因来提高重组蛋白质分泌表达效率的方法，其中//p/WC/基因编 码/ ofyww7 /2中未折叠蛋白质反应的 一个关键调节因子，并阐明了 //p/i4a介导的 调节机制。
技术介绍
包括酵母在内的所有真核细胞都有一个叫内质网(ER)的细胞器来负责运送分泌性 蛋白质和膜蛋白质。这就是说被运送到细胞外而非细胞质的分泌性蛋白质在核糖体被翻 译并立即易位到内质网。在这种分泌途径中，错误折叠的蛋白质被蓄积而产生内质网应 激从而活化应激反应机制即UPR,这是为了消除所产生的内质网应激(或者分泌应激) 反应。从单核的真核微生物酵母到最高级的真核生物人的所有真核细胞内都发现有 UPR。采用2000年(Cell 101， 249, 2000)的传统酵母即酒酿酵母(S.匿v油e )在基因 水平上进行了酵母的UPR机理的研究。它证实了 UPR的潜在调控和作用机理(Cell 107, 103， 2001; Nature 415, 92， 2002)。酵母的URP最初显示主要受调控转录因子Haclp的调控，Hac/p由S. revWae里 的ii4C7基因编码。然而，随后对高等生物URP机理的研究更加地活跃，除了与哺乳 动物同系物的Haclp相应的XPB1蛋白质外，还发现了大量的调节因子如ATF6和PERK 蛋白质。酵母作为单核的真核微生物和高等的真核生物一样具有相同的细胞器，它们的分泌 机制也彼此非常相似。因此，酵母被认为是易于低成本表达人源蛋白质的优良的重组蛋 白质表达宿主。在动物细胞表达体系中，具有表达人源复杂糖蛋白质的优势。然而，这个体系的主 要缺点是产率低、成本高以及建立细胞系的周期长。此外，病毒和朊病毒感染的风险也 成为问题，这是因为动物细胞非常类似于人细胞。相反，酵母是一个更实用的表达系统，它可以在较低成本下容易产出想得到的重组蛋白质并且已经有数千年被人类利用于发 酵过程。目前， 一些酵母菌抹具有GRAS (公认安全)状态。在各种酵母种属中，传统的酵母S. cerev/w'ae是生物学研究的一个主体并且已将其 开发为生产重组蛋白质的宿主。然而，相比较于其他工业用酵母如巴斯德毕赤酵母或者 多形汉森酵母，51. ceWw》e分泌机能活化的有工业用途的蛋白质的能力较低。因此， 非酿酒酵母菌逐渐代替51. ce^w'wV^成为分泌表达的宿主。最近，曱基营养型酵母H. polymorpha作为一个具有优良分泌表达重组蛋白质能力 的宿主引起了人们很大的兴趣。大量成功使用po(yww7 /2a表达体系生产肌醇六磷酸 酶(13.5 g/L)和医用乙型肝炎疫苗的案例被报道。尤其是，乙肝疫苗大量生产的实现归 功于//. pofymo 7^a作为生产宿主的经济的优势，以便重组疫苗可以低价供给给许多第 三世界国家，从而有助于改善全人类的福利。H. polymorpha已经是国际公认的一个为工业和医疗用途大量生产重组蛋白质的优 良宿主体系。因此，使用//.; o/jww7^a生产重组蛋白质技术的发展在生物
被 认为非常有益。相应地，在工业和市场领域，也有必要通过提高它表达和分泌重组蛋白 质的能力将其H. polymorpha开发成为有效地生产高品质分泌蛋白质包括人源糖蛋白质 的宿主体系。在过去的十年里，本专利技术者已经进行了将H /K^WW^/jfl开发为分泌表达重组蛋白质宿主的基础和应用研究，并在最近开发了一个全基因组微点阵体系来分析H po/jwwp/za在基因水平的调控机制。为了提升细胞重塑技术来优化// pofywo^p/za的分 泌表达能力，我们分离出一个H/ 0(yww7^a/i4a基因(i/; /i4C7),它编码在未折叠蛋 白质反应中所涉及的一个重要调节转录因子，并开发了它的缺失和过表达菌抹，以便于 分析它们的特征。此外，本专利技术者为了给理解减轻分泌应激的URP机理提供一个基础， 对它们进行了微矩阵分析，以及提供了 一种优化H pofymo/7 /w的分泌表达能力的方法， 因此完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供了一种蛋白质，所述的蛋白质具有增强在减轻分泌应激的 反应中所涉及的基因的表达，其中该蛋白质具有SEQ ID NO: 3表示的氨基酸序列或者 具有与其有卯％或更多同源性的氨基酸序列。本专利技术的另一个目的是提供了编码所述蛋白质的核酸，优选包含SEQ ID NO: 2或 者SEQ ID NO: 1表示的核酸序列，其中在进行特异于该基因的剪接前SEQ ID NO: 1是 SEQIDNO:2的前体，或SEQIDNO:l的片段。本专利技术的另一个目的是提供一个重组载体，所述载体包含的核酸所编码的蛋白质具 有增强在减轻未折叠蛋白质应激反应中所涉及的基因的表达的能力，其中该蛋白质具有 SEQ ID NO: 3所表示的氨基酸序列或者与其有90%或更多的同源性的氨基酸序列。本专利技术的另 一个目的是提供一个用重组载体转化的大肠杆菌宿主细胞。本专利技术的另 一个目的是提供一个用重组载体转化的//. jwfywowto宿主细胞。本专利技术的另一个目的是提供含有减少的未折叠蛋白质反应的//. jw(ym0 7^fl突变 抹，它可通过缺失或突变/^/WC/基因而获得，其中/// /i4C7基因编码一种新的转录因 子。该转录因子能增强在减轻未折叠蛋白质应激反应中所涉及的基因的表达。本专利技术的另一个目的是开发一种显示细胞良好生长的生产宿主，在该宿主里 HpHACl基因能持续表达。本专利技术的另一个目的是提供一种制备生产宿主的方法，该宿主有改善的重组蛋白质分泌表达的能力，其中7fp/a基因是持续表达或者过表达的。 附图简述附图说明图1A说明了 H po/ymor/^a的Z/; /i4C/基因的核酸序列。并且图1B说明了逆转录 酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析剪接的HpHACl基因以及其图解。RT-PCR的产物通过 琼脂糖凝胶电泳根据大小的不同得到分离，通过剪接得到的氨基酸序列大小减小的核酸 片段经分析证实具有HAC1的特异性剪接位点，下划线的位置(图1)。由于剪接而改 变的剪接前后的每个终止密码子如粗体所示。图2A显示了 ///wfywor/^a和5. cem;/w'oe/i4。蛋白质的氨基酸序列分析结果。 图2B是显示两个酵母菌HAC1蛋白质间具有高度同源性的结构域的图。图3A和B显示了 7/. /wfywwp/w分泌应激减轻反应URP (未折叠蛋白质反应)诱 导条件的探究结果。图3A是基于剪接状态的HpHACl mRNA的条件下的分析结果，图 3B是H /w(ywor/ /z基因(HpKAR2、 HpPDIl 、 HpEROl)相当于S. cerev/w'ae内的已知的 URP靶基因的表达水平变化时的分析结果。野生型的H. polymorpha菌抹被培养到指数 生长期，用5 ug/ml的衣霉素，5 mM DTT ( 二硫苏糖醇)和Blefddin A的最佳浓度处 理30分钟，60分钟和120分钟，收集用于实验。图4是为了删除//. ; ofy本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有增强基因表达活性的蛋白质，所述的基因参与减缓分泌应激，其中该蛋白质具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３表示的氨基酸序列或与其有９０％或更多同源性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR 2006-6-16 10-2006-00545571. 一种具有增强基因表达活性的蛋白质，所述的基因参与减缓分泌应激，其中该蛋白质具有SEQ ID NO3表示的氨基酸序列或与其有90％或更多同源性的氨基酸序列。2. —种编码权利要求1所述的蛋白质的核酸或其片段。3. 根据权利要求2所述的核酸或其片段，具有SEQ ID NO: 1或2表示的核苦酸序列。4. 一种包含权利要求2所述的核酸或其片段的重组载体。5. —种包含SEQIDNO:2表示的DNA基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜贤雅，文惠妍，吴斗炳，李尚基，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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