一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法技术

本发明专利技术提供了一种米糠谷蛋白来源的生物活性肽，其序列为KHNRGDEF；本发明专利技术的活性肽具有抗氧化活性，可用于制备增加抗氧化功效的食品和保健品。本发明专利技术从米糠谷蛋白的酶解产物中分离获得一种具有体外抗氧化活性的多肽，通过碱提酸沉法提取粗谷蛋白，之后再分级提取，接着选用离子交换层析和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将所得米糠谷蛋白用碱性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，得到抗氧化活性肽产品，其酶解条件为[E]/[S]1.5%‑1.8%、pH10.0、温度50℃、时间4.2h，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP‑HPLC及分析型RP‑HPLC分离纯化得到所需的抗氧化活性肽纯品。本发明专利技术生产成本低、工艺简便、绿色环保，所得米糠活性肽具有合理氨基酸组成、低过敏性、安全可靠等特点，且其具有较好的自由基清除能力，具有良好的抗氧化功效。

Method for separating and preparing rice bran antioxidant active peptide

The invention provides a bioactive peptide derived from the glutelin of rice bran, wherein the sequence is KHNRGDEF; the active peptide of the invention has antioxidant activity and can be used for preparing foods and health-care products which can increase the antioxidation effect. The invention provides a peptide with antioxidant activity in vitro was separated from the products of rice glutelin by enzyme, alkali extraction and acid precipitation method to extract crude gluten, after extraction, then using ion exchange chromatography and gel chromatography technology of rice bran gluten were isolated and purified, then by alkaline protease hydrolysis, centrifugation, vacuum concentration, the frozen rice bran glutenin dry, product antioxidant peptide, the enzymatic hydrolysis conditions for [E]/[S]1.5%, 1.8% pH10.0, temperature 50, time 4.2h, after using ion exchange chromatography, gel chromatography, preparation and analysis of RP HPLC RP HPLC purified antioxidant peptide required for the pure product. The invention has the advantages of simple process, low production cost, green environmental protection, the activity of rice bran peptide has reasonable amino acid composition, hypoallergenic, safe and reliable, and has better ability of scavenging free radicals, has good antioxidant effect.

【技术实现步骤摘要】
一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法
本专利技术涉及一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法。
技术介绍
米糠是大米生产工厂中产生较多的副产物，其蛋白质氨基酸组成与大米中蛋白质氨基酸组成相似，氨基酸组成合理，均为优质蛋白。我国每年工业生产都会产生大量的米糠，而其中大部分未得到有效利用，因此需要对米糠蛋白进行深加工以提高其附加值，实现资源充分利用。大米以及米糠中的蛋白溶解性差，严重影响其应用。而米糠中的分子量较小的肽段则具有较好的溶解性，且不同的肽段具有不同的功效，如抗氧化性、降血压、免疫活性等。大米抗氧化活性肽具有良好的自由基清除能力，在预防自由基诱发的心脑血管疾病方面有很大的开发潜力。大米活性肽对氧化损伤诱导的自由基有很好的清除作用，可提高人体细胞抗氧化能力。经过调研，未见我国学者利用中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽的相关文献报道，因此中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽等研究领域尚处于空白阶段。本研究发现利用中性蛋白酶提取米糠蛋白中的大米活性肽具有清除自由基、抑制细胞氧化的作用，有效提高米糠的附加价值，实现米糠的高值化利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法，是以米糠为原料，利用中性蛋白酶制备具有抗氧化活性的肽产品，以实现米糠的高值化利用。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述米糠抗氧化活性肽的分离制备方法是通过碱提酸沉法和Osborne分级提取脱脂米糠来获得米糠谷蛋白，然后选用离子交换和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将分离纯化后的米糠谷蛋白用碱性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP-HPLC及分析型RP-HPLC分离纯化得到抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述碱性蛋白酶水解的条件为[E]/[S]1.5％—1.8％、pH值为10.0、温度为50℃、反应时间为4.2h。优选地，所述方法具体包括如下步骤：(1)谷蛋白的提取：脱脂米糠→加水并调pH值为9.0，料液比为1:10，所述料液比的单位为mL/g，40℃水浴4h→离心→取上清液→pH值为4.0条件下酸沉→离心→取沉淀→水洗，调pH值为7.0→冷冻干燥→碱提米糠谷蛋白→Osborne分级提取，得到米糠谷蛋白；(2)选用pH值为10.0，浓度为0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3作为缓冲液对大米谷蛋白进行初步的分离；以pH值12.0，浓度为0.05mol/LNa2HPO4-NaOH缓冲液溶解碱提米糠谷蛋白，利用DEAE-52阴离子交换层析介质对碱提米糠谷蛋白进行进一步分离纯化；(3)制备米糠蛋白悬浮液，按碱性蛋白酶/谷蛋白质量比为1.5％-1.8％的比例添加碱性蛋白酶→调pH值为10.0→50℃下超级恒温水浴酶反应器中溶解30min→酶解4.2h→灭酶→离心→取上清液→真空浓缩→冷冻干燥，得大米谷蛋白肽；(4)对大米谷蛋白肽进行分离纯化后得抗氧化活性肽。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术所述大米活性肽的制备方法包括以下步骤：(1)谷蛋白的提取：通过碱提酸沉法提取谷蛋白，选用离子交换和凝胶层析技术对大米谷蛋白进行分离纯化；(2)米糠谷蛋白的水解：5％(w/v，g/mL)米糠谷蛋白悬浮液→调pH值→一定温度下超级恒温水浴酶反应器中溶解30min→按一定的底物浓度、加酶量、pH值、温度进行酶解(恒pH滴定仪使体系pH稳定)→85℃，10min灭酶→3500r/min离心15min→上清液→真空浓缩→冷冻干燥→米糠谷蛋白肽；(3)米糠谷蛋白肽的分离纯化①利用SP-SephadexG-25作为离子交换层析介质，pH4.0，0.02mol/LHAc-NaAc为起始缓冲液，流速2mL/min，用平衡缓冲液、含0.5mol/LNaCl的平衡缓冲液和含1mol/LNaCl的平衡缓冲液梯度洗脱，选取米糠谷蛋白水解产物多个肽组分中自由基清除能力最强的组分。②利用SephadexG-15凝胶层析将①所选组分分离成几个组分，选取自由基清除能力最强的组分。③利用制备RP-HPLC将上个步骤所选组分进一步分离，选取几个主要组分，通过测定各主要组分的自由基清除能力筛选出抗氧化活性较强的组分，再经RP-HPLC分析是否为相对单一峰。(4)采用MALDI-TOF/TOFMS质谱分析法测得提取出的大米活性肽的相对分子量。结合TOF-MS/MS串联质谱得出其氨基酸组成和其排列顺序。与现有技术相比，本专利技术方法制备的米糠活性肽更有效的利用了米糠，提高了大米生产中副产物的利用，也节约了生产成本，对实现米糠蛋白的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。附图说明图1为TOF-MS/MS串联质谱测定结果图；图2为离子交换层析分离得到的组分PA-PG的ABTS·+自由基清除能力；**表示清除率最高的组分和其他组分之间存在显著性差异；图3为凝胶层析分离得到的组分PF1-PF4的ABTS·+自由基清除能力；**表示清除率最高的组分和其他组分之间存在显著性差异；图4为RP-HPLC分离得到的组分PF3-α到F3-γ的ABTS·+自由基清除能力；**表示清除率最高的组分和其他组分之间存在显著性差异。具体实施方式实施例1所述米糠抗氧化活性肽的分离制备方法包括如下步骤：(1)碱提酸沉法提取米糠谷蛋白的工艺流程为：脱脂米糠(过60目筛)→加水并调pH9.0(料液比1:10，所述料液比的单位为mL/g，水浴：40℃，4h)→离心(8000r/min，15min)→取上清液→酸沉(pH4.0)→离心(8000r/min，15min)→取沉淀→水洗三次，调ph7.0→冷冻干燥(48h)→碱提米糠谷蛋白(4℃密封储藏+硅胶)→Osborne分级提取，得到较纯的谷蛋白；(2)选用Na2CO3-NaHCO3(pH10.0，0.1mol/L)作为缓冲液对大米谷蛋白进行初步的分离。以0.05mol/LNa2HPO4-NaOH(pH12.0)缓冲液溶解碱提米糠谷蛋白，利用DEAE-52阴离子交换层析介质对碱提米糠谷蛋白进行了进一步分离纯化，依次用0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L、0.55mol/L的含盐缓冲液阶段洗脱碱提大米谷蛋白，分离得到五个洗脱峰R1、R2、R3、R4、R5，采用HPLC对R3组分进行纯度分析，其纯度为71.55％。收集R3采用SephadexG-75凝胶过滤层析进一步纯化，得到R3-α、R3-β、R3-γ三个洗脱峰，经HPLC检测，其中R3-γ洗脱峰的分子量为37530.34，纯度达93.45％；(3)5％(w/v，g/mL)米糠谷蛋白悬浮液，按照碱性蛋白酶/谷蛋白为1.5％-1.8％(g/g)的比例添加碱性蛋白酶→调pH值为10.0→50℃下超级恒温水浴酶反应器中溶解30min→酶解4.2h(用pH滴定仪使体系pH稳定)→85℃，10min灭酶→3,500r/min离心15min→上清液→真空浓缩→冷冻干燥→大米谷蛋白肽；(4)大米谷蛋白肽的分离纯化①利用SP-SephadexC-25作为离子交换层析介质，pH4.0，0.02mol/LHAc-NaAc为起始缓冲液，流速2mL/min，用平衡缓冲液、含0.5mol/LNaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法，其特征在于，所述方法是通过碱提酸沉法和Osborne分级提取脱脂米糠来获得米糠谷蛋白，然后选用离子交换和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将分离纯化后的米糠谷蛋白用碱性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP‑HPLC及分析型RP‑HPLC分离纯化得到抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法，其特征在于，所述方法是通过碱提酸沉法和Osborne分级提取脱脂米糠来获得米糠谷蛋白，然后选用离子交换和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将分离纯化后的米糠谷蛋白用碱性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP-HPLC及分析型RP-HPLC分离纯化得到抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶水解的条件为[E]/[S]1.5%—1.8%、pH值为10.0、温度为50℃、反应时间为4.2h。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：（1）谷蛋白的提取：脱脂米糠→加水并调pH值为9.0，料液比为1:10，所述料液比的单位为mL/g，40...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁盈，林亲录，王玉倩，李佳佳，黄萍，张琳，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43