本发明专利技术提供一种了猪圆环病毒2型3个Cap基因重组杆状病毒疫苗的构建和应用。本发明专利技术将猪圆环病毒2型的3个Cap基因头尾相连，连接到杆状病毒载体pFastBacDual，得到了能够稳定表达3个Cap基因的重组真核表达载体pFBD‑3Cap，将该重组表达载体转染sf9细胞，获得了能够表达猪圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒。经PCR和western‑blot鉴定证实，该重组杆状病毒能够稳定表达3个Cap基因，能与猪圆环病毒免疫血清发生反应，表明本发明专利技术所制备的重组蛋白与猪圆环病毒天然抗原一样具有相同的抗原性。本发明专利技术所述疫苗是一种能够用于猪圆环病毒2型的安全、有效的重组杆状病毒疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗的构建和应用。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，是无囊膜单股环状DNA病毒，为已知的最小动物病毒之一，其基因组全长1767bp或1768bp。PCV2能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)及其他猪圆环相关疾病(PCVAD)。目前该病在我国广泛流行，据报道，PCV2在猪群的感染率可达80％以上，给养猪产业造成了严重的经济损失。PCV2含有11个开放阅读框架(ORF)，分别为ORF1-ORF11。研究表明，ORF2编码的核衣壳蛋白(Cap)具有较高的免疫原性，能诱导中和抗体的产生，是构建重组疫苗的首选基因。以往研究发现，猪圆环病毒灭活苗存在效价不高，免疫原性不强等缺点，利用大肠杆菌等载体表达的亚单位疫苗又存在糖基化不完全、诱导的抗体滴度不高等无法克服的缺陷，所以如何利用Cap基因制备DNA疫苗或亚单位疫苗就成为防治猪圆环病毒病的关键。
技术实现思路
针对上述
的现状，本专利技术提供了一种猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗的构建和应用，本专利技术的目的之一是提供猪一种猪圆环病毒3个Cap基因串联的重组杆状病毒；本专利技术的目的之二是提供含有上述猪圆环病毒3个Cap基因串联的重组杆状病毒表达的Cap蛋白；本专利技术的目的之三是提供构建上述重组杆状病毒疫苗的引物；本专利技术的目的之四是提供构建猪圆环病毒3个Cap基因的串联产物。为实现上述专利技术目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒，其微生物保藏号是：CCTCCNo.V201549，分类命名为：重组杆状病毒AcNPV/pBac-3Cap，保藏时间为：2015.11.13，保藏单位是：中国典型培养物保藏中心，保藏地址是：湖北省武汉市武汉大学校内。本专利技术还提供了能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒在制备猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗中的应用。其中，一种猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗，含有所述能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒。进一步的，所述猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗的制备方法如下：(1)猪圆环病毒2型3个Cap基因头尾相连成重组基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；(2)将上述步骤(1)中的重组基因连接到杆状病毒载体pFastBacDualp，得到能够稳定表达3个Cap基因的重组真核表达载体pFBD-3Cap；(3)将上述步骤(2)中得到的重组真核表达载体转染sf9细胞，使3个串联Cap基因在sf9细胞中表达，得到能够表达猪圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒；(4)将所述重组杆状病毒制成疫苗。进一步的，上述猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗的制备方法中，所述步骤(3)中重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术与现有技术相比有许多优点和积极效果：本专利技术所建立的猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗是基于对以往的猪圆环病毒疫苗的深入研究分析后，改进的一种疫苗。研究表明，ORF2编码的核衣壳蛋白(Cap)具有较高的免疫原性，能诱导中和抗体的产生，本专利技术将其作为构建重组疫苗的首选基因，解决了现有技术中猪圆环病毒灭活苗存在效价不高，免疫原性不强及利用大肠杆菌等载体表达的亚单位疫苗又存在糖基化不完全、诱导的抗体滴度不高等缺点。本专利技术所述疫苗是一种能够用于猪圆环病毒2型的安全、有效的重组杆状病毒疫苗。附图说明图1是Cap基因的PCR产物电泳结果。图2是3个Cap基因pcDNA4-His/Max-Cap，pcDNA4-His/Max-2Cap，pcDNA4-His/Max-3Cap的酶切鉴定检测结果。图3是3个Cap基因的重组表达质粒转染sf9细胞后的细胞病变结果(400×)。图4是含有3个Cap基因的重组杆状病毒感染sf9细胞后进行的SDS-PAGE鉴定结果。图5是含有3个Cap基因的重组杆状病毒感染sf9细胞后进行的Western-blot分析结果。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细的描述。实施例11.Cap基因特异性引物的设计和合成根据猪圆环病毒Cap基因以及需要实现2个Cap基因和3个Cap基因串联，故设计以下6条特异性引物,在引物P1上面添加了BamHI和PstI限制性内切酶酶切位点。构建重组PCV2疫苗的引物如下：P1：CGGTACCCGGGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCGP2：CGACTCTAGAGGATCAAGCTTTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCP3：AATGGCATCTTCAACACCCGP4：GTTGAAGATGCCATTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCP5：GGCATCTTCAACACCCGCCTCP6：GGTGTTGAAGATGCCATTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC这些引物合成后，分别用灭菌水稀释溶解，工作浓度为20μmol/L，备用。2.重组杆状病毒载体的构建以提取的PCV2基因组DNA作为模板，用引物P1-P6分别进行PCR扩增,扩增相应的目的片段。扩增体系：10×PCRBuffer5μL，dNTPMix(2mM)3μL，Template1μL，引物各1μL，TaqDNAPolymerase0.5μL，ddH2O38.5μL；PCR扩增条件为：95℃预变性5min、95℃30s、56℃30s、72℃30s，35个循环后72℃延伸10min。图1是Cap基因的PCR产物电泳结果，其中，M：DNA标准DL2000；1-5：PCR扩增产物。用HDCloningKit和puc19载体分别构建含有1-3个Cap基因的重组载体pUC-Cap、pUC-2Cap和pUC-3Cap，然后分别用BamHⅠ和HindIII双酶切pUC-Cap、pUC-2Cap和pUC-3Cap和pFastBacHTB质粒，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段。将回收的Cap、2Cap、3CapDNA片段与pFastBacHTB载体于16℃连接过夜并转化入DH5α中，然后在含氨苄西林和卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12-24h，通过质粒双酶切进行鉴定。图2是3个Cap基因pcDNA4-His/Max-Cap，pcDNA4-His/Max-2Cap，pcDNA4-His/Max-3Cap的酶切鉴定检测结果，其中，M：DNA标准DL15000；1：pcDNA4-His/Max-Cap的BamHI+PstI双酶切鉴定；2：pcDNA4-His/Max-2Cap的BamHI+PstI双酶切鉴定；3：pcDNA4-His/Max-3Cap的BamHI+PstI双酶切鉴定。鉴定正确的质粒命名为pFastBacHTB-Cap，pFastBacHTB-2Cap和pFastBacHTB-3Cap。3.重组杆状病毒的制备将整管高效DH10BacTM感受态细胞冰上解冻，轻轻地混合，同时将100ul本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒，其以保藏号CCTCC No.V201549，保藏于中国典型培养物保藏中心。
【技术特征摘要】
1.一种能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒，其以保藏号CCTCCNo.V201549，保藏于中国典型培养物保藏中心。2.权利要求1所述的能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒在制备猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗中的应用。3.一种猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的能表达猪圆环病毒2型3个Cap基因串联的重组杆状病毒。4.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型3个Cap基因串联重组杆状病毒疫苗，其特征在于，上述疫苗的制备方法如下：（1）猪圆环病毒2型3个Cap...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓成，张志，吴发兴，刘爽，董雅琴，邵卫星，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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