一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取出纯度近100％的AT-III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。此外，本发明专利技术还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取利用α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III以及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离提取，可有效降低α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，并可实现大规模工业化生产。本发明专利技术的方法能显著提高血浆综合利用效率，具有较强的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于血液制品领域，涉及血浆的综合利用，尤其涉及从制备人血白蛋白的废弃物中回收制备抗凝血酶III以及多种功能蛋白的方法。
技术介绍
血液蛋白制品由健康人的血液、血浆或特异免疫人血浆分离提纯制成的有明确临床应用意义的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子(天然或重组的)、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防，在临床上发挥着重要作用。血浆蛋白的分离纯化，根据各种血浆蛋白的理化性质或生物特性的不同对其进行分离。目前采用的方法有低温乙醇法、层析法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇沉淀法和热乙醇法等等。其中低温乙醇法又称Cohn法，是由E.J.Cohn等专利技术的采用冷乙醇分离人血浆蛋白的方法，包括一系列改进。这些方法目前仍被国内外血液制品企业广泛采用。例如，美国、日本主要是用Cohn6+9法(Cohn-Oncley法)，而西欧国家则使用Nitschmann和Kistler法(简称N-K法)。我国的生产单位根据各自情况分别采用这两种方法。Cohn法采用一系列不同浓度的乙醇对人血浆进行分级沉淀，富集和分离目标产品。以经典的N-K法为例，可把血浆蛋白分级为I–V的组分，其中分别制备成人血白蛋白(组分V)、凝血因子(组分I)和人免疫球蛋白(组分II+III)，组分IV则被当成废弃物。表1.N-K法分离血浆蛋白的组分Cohn组分IV沉淀(CohnFIV)作为低温乙醇法中的废弃组分，其中含有多种具有药用价值的血浆蛋白。沉淀中的主要蛋白成分(见表1)为白蛋白和一些血浆中含量较少的微量蛋白，如运铁蛋白、AT-III(抗凝血酶III)、α1-AT(α1-抗胰蛋白酶)和结合珠蛋白等。这些蛋白中间，目前具有实际临床应用价值的蛋白主要是AT-III和α1-AT，其他几种微量蛋白在成药性方面目前还处于研究阶段。国外已有多种AT-III和α1-AT制品上市，而国内目前还没有AT-III和α1-AT制品进入市场，特别是在现在血浆蛋白产品市场供应短缺的情况下，从Cohn法组分IV沉淀中回收这些功能蛋白具有重要意义。目前已有大量从Cohn法组分IV沉淀中回收单一功能蛋白的报道。例如，吴强等公开了一种从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的方法，采用PEG沉淀加两步肝素亲和层析，获得的AT-III比活为6.9IU/mg，参见专利201210544111.X。采用这种方式制备AT-III在规模化生产时需要大量的PEG和肝素亲和凝胶，其最大的缺点就是制备成本较高。胡吉军等人公开了采用一步肝素亲和层析法从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的专利，参见专利200310030446.4。这种方法虽然成本较小，但是制备的AT-III比活度不高，纯度也难达到100％。从组分IV沉淀中回收各种功能蛋白，在投浆量较小的情况下，如何既能有效的降低投入产出比，又能得到质量属性相对较高的产品是目前国内血液制品行业面临的一个难题，现有制备AT-III的主流工艺基本都采用PEG沉淀加肝素亲和层析或两步肝素亲和层析，且都是一种单一制品的制备模式，这些方式要么成本较高，要么质量标准不高。另外，叶生亮等公开了一种从Cohn法组分IV沉淀中分离纯化α1-AT制剂的工艺，分别采用阳离子交换层析CMSepharoseFF和阴离子交换层析QSepharoseFF获得α1-AT，比活为0.94PU/mg，纯度达95％以上，活性回收率为38.2％，参见《中国输血杂志》，2012(S1):65-66，但是采取这种方法却无法有效的将白蛋白和α1-抗胰蛋白酶进行分离。近年来也有一些Cohn法组分IV沉淀综合利用，同时回收多种功能蛋白的报道。例如，白高英等报道对Cohn法组分IV沉淀预处理液首先进行疏水层析，分成三个组分：第一组分采用离子交换层析得到运铁蛋白；第二组分采用离子交换层析得到α1-AT；第三组分采用肝素亲和层析分别得到AT-III和白蛋白，获得的AT-III、α1-AT收率分别为70％和65％，参见2010年兰州大学硕士学位论文《Cohn组分IV沉淀中血浆蛋白的分离工艺及过程自动化研究》。苏志国、李岩等公开了一种综合利用Cohn法组分IV沉淀的方法，作者采用不同pH的溶液对沉淀进行分步溶解，将不同的蛋白富集在不同的pH缓冲液中，再将溶出液用离子交换层析进行处理，最后得到了AT-III、α1-AT、铜蓝蛋白以及白蛋白等蛋白，参见专利CN201210438973.4。以上两种Cohn法组分IV沉淀的综合利用方法只是实验室规模的试验，未涉及到各功能蛋白的病毒灭活和活性检测，一些有关收率、比活等方面的关键质量指标都没有公开，从放大至规模化生产的角度来看还缺乏足够的数据支持，而本领域迫切需要可用于大规模生产的Cohn法组分IV沉淀综合利用方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取出纯度为99.5％以上的AT-III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。此外，本专利技术还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III以及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离，可有效降低α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，并可实现大规模工业化生产。一方面，本专利技术提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT-III)的方法，所述方法包括：将血浆Cohn法组分IV沉淀依次进行阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析，并收集疏水层析之后的穿流液，得到抗凝血酶III(AT-III)。优选的，所述提取抗凝血酶III(AT-III)的方法在层析步骤之前还包括病毒灭活的预处理步骤，更优选的，所述病毒灭活的预处理步骤是通过S/D法进行或巴氏灭活法进行。更优选的，本专利技术提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT-III)的方法，所述方法包括以下步骤：(1)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween-80/0.3％TNBP，对血浆Cohn法组份IV沉淀溶液进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6.00～7.50；(2)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6.00～7.50的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析柱3～6个柱体积后上样，用pH6.00～8.5的缓冲液洗柱2～5个柱体积，用pH6.00～8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；(3)肝素亲和层析吸附目的蛋白：将肝素亲和柱用含0.1～0.5MNaCl的pH6.0～8.5的缓冲液平衡层析柱2～6个柱体积，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT‑III)的方法，其特征在于，所述方法包括：将血浆Cohn法组分IV沉淀依次进行阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析，并收集疏水层析之后的流穿液，得到抗凝血酶III(AT‑III)。

【技术特征摘要】
1.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT-III)的方法，其特征在于，所
述方法包括：将血浆Cohn法组分IV沉淀依次进行阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层
析，并收集疏水层析之后的流穿液，得到抗凝血酶III(AT-III)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在层析步骤之前还包括病毒灭活的预处理步
骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒灭活的预处理步骤是通过S/D法进
行或巴氏灭活法进行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween-80/0.3％TNBP，对血浆Cohn法组份IV
沉淀溶液进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6-7.5；
(2)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6-7.5的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析
柱3-6个柱体积后上样，用pH6-8.5的缓冲液洗柱2-5个柱体积，用pH6-8.5的高
盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(3)肝素亲和层析吸附目的蛋白：将肝素亲和柱用含0.1-0.5MNaCl的pH6-8.5的缓冲
液平衡层析柱2-6个柱体积，将步骤(2)的洗脱液上样层析柱，用pH6-8.5并含有
10-500mmol/L柠檬酸和0.5-2mol/LNaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(4)疏水层析进行精纯：将疏水层析柱用pH6-8.5并含有10-500mmol/L柠檬酸和0.5-2
mol/LNaCl的缓冲液平衡2-6个柱体积后，上样步骤(3)的洗脱液，收集上样后的
流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液脱盐、浓缩、膜过滤除病毒、除菌分装、冻干，得到抗凝血酶
III制品。
5.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，其特征在于，所述
方法包括：通过权利要求1-4中任一项所述的方法收集抗凝血酶III(AT-III)，通过AATSelect
亲和层析收集α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述AATSelect亲和层析是在阴离子交换
层析和肝素亲和层析之间进行，或者是在肝素亲和层析之后进行。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肝素亲和层析和AATSelect亲和层析
为串联形式，一次上样，两柱分离后分别洗脱。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，在通过AATSelect亲和层析之后，

\t进一步通过分子排阻层析纯化，得到α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。
9.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，其特征在于，所述
方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁凌宇，蒋琳，郭玉婷，杨军，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62