包含脂质体的组合物经常用于输送核酸到哺乳动物用于治疗性蛋白的外源表达，疾病引发蛋白质的表达抑制，或用于诱导针对疾病引发病原细胞或癌细胞的免疫应答。这些组合物的脂质体‑核酸复合物通常作为分散相悬浮在药学上可接受的含水载体中，所述含水载体构成连续相以形成水包油乳状液。通过使用疏水载体——而不是含水载体——的连续相来携带封装核酸的脂质体的分散相，产生了这样的组合物，其更有效地输送核酸到哺乳动物对象，除了被封装在脂质体外，核酸也可以作为油包水乳状液存在于疏水载体中。
【技术实现步骤摘要】
本申请是专利技术名称为”在包括连续疏水相的载体中的脂质体在体内输送多核苷酸中的应用”、申请号为“200880108975.9(PCT/CA2008/001678)”、申请日为2008年9月24日的申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2007年9月27日提交的美国临时专利申请号60/975,602和2008年6月13日提交的美国临时专利申请号61/061,303的权益和优先权，其中这两个申请通过引用全部并入本文。专利
本申请涉及组合物在体内输送多核苷酸中的应用，所述组合物包含脂质体和作为载体的连续疏水相。专利技术背景对将核酸有效导入靶细胞和组织用于例如基因治疗已进行了很多研究。这种核酸可以是例如编码基因产物的序列或是短核苷酸序列，其对应特异基因或它们的产物的正义或反义序列，并且因此直接影响这些基因和/或它们的产物的表达。在将核酸输送至正确的靶位点和足够数量的靶细胞方面仍然存在问题。核酸要经受核酸酶攻击并且通常不能穿过细胞膜。已提出大量的输送方法，包括显微注射、划痕负载(scrapeloading)和受体介导的内吞作用。基于脂的载体系统，包括涉及使用脂质体的那些，经常用于包装治疗性核酸。但是，脂质体的使用可能引起问题，例如包装效力差和从循环中快速去除。还可能在包装足够的核酸而不增加脂质体大小到向靶组织的输送不受损的点方面存在问题。因此，存在对开发基于脂质体的输送系统用于将核酸靶向至正确的靶组织的需要。专利技术概述一方面，本专利技术提供组合物，其包含：包括连续相疏水物质的载体；脂质体和多核苷酸。另一方面，本专利技术提供用于将多核苷酸输送给对象的方法，其包括将如上所述的组合物施用给对象。在阅读本专利技术的具体实施方式的下列描述并结合附图后，本专利技术其它方面和特征对本领域普通技术人员将变得显而易见。附图简述在附图中，仅通过实例的方式图示了本专利技术的实施方式：图1图示了在从注射后8天的淋巴结分离的细胞中的IL-12表达潜力。图2图示了在从注射后8天的淋巴结分离的细胞中的IL-12表达潜力。将每组小鼠中检测的IL-12蛋白水平进行平均。图3图示了在从注射后8天的淋巴结分离的细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)表达潜力。组1(在PBS中的GFP)、组2(GFP/脂质体/疏水载体)、组3(GFP/疏水载体)和组4(GFP/脂质体)动物的淋巴结细胞含有可检测的GFP表达细胞，其高于水平线所代表的背景荧光。使用组5(脂质体/疏水载体，无GFP)和组6(未处理的小鼠)对照动物的淋巴结细胞荧光计数评价背景荧光。使用学生T检验(studentTtest)计算P值。图4图示了在接种后8天显示GFP表达的CD11b/CD11c阳性淋巴结细胞。重新分析图1提供的数据以比较组1-6动物淋巴结中的CD11b/CD11c和GFP阳性细胞的数量(图1所述)。以总淋巴结细胞的百分比计算CD11b/CD11c阳性、GFP阳性细胞的数量。图5图示了在注射IL-12siRNA后，在从淋巴结分离的细胞中，对质粒IL-12诱导的IL-12蛋白表达的抑制。将每组小鼠中检测的IL-12蛋白水平进行平均。淋巴结细胞来自组1(只有pORF-mIL-12质粒，无siRNA)、组2(pORF-mIL-12质粒，在PBS中的IL-12-siRNA)、组3(pORF-mIL-12质粒，在脂质体/疏水载体中的IL-12-siRNA)和组4(未处理的、首次进行实验的小鼠(mice))。使用学生T检验计算P值。图6图示了在注射IL-12siRNA后，在从淋巴结分离的细胞中，对卵清蛋白-诱导的IL-12蛋白表达的抑制。将每组小鼠中检测的IL-12蛋白水平进行平均。淋巴结细胞来自组1(第0天在CFA中的卵清蛋白，无siRNA)、组2(在CFA中的卵清蛋白，在PBS中的IL-12-siRNA，第负1天)、组3(在CFA中的卵清蛋白，在脂质体/疏水载体中的IL-12-siRNA，第负1天)、组4(在CFA中的卵清蛋白，在PBS中的IL-12-siRNA，第正1天)、组5(在CFA中的卵清蛋白，在脂质体/疏水载体中的IL-12-siRNA，第正1天)和组6(未处理的首次进行实验的小鼠)。使用学生T检验计算P值。专利技术详述本专利技术提供用于将多核苷酸输送至对象的组合物。多核苷酸如本文所述多核苷酸的使用具体是指这样的多核苷酸，其含有的序列很大程度上相对应于特异基因或它们的产物的正义或反义序列，并因此对这些基因和/或它们的产物的表达具有直接作用。例如，含有基因编码序列的多核苷酸的使用影响在吸收这些多核苷酸的细胞中感兴趣基因的转录和/或翻译。类似地，RNA干扰多核苷酸的使用通过直接影响在吸收这些核苷酸的细胞中mRNA的水平来影响感兴趣的特异基因的表达。这明显不同于其它基于多核苷酸的分子，例如CpG和polyIC佐剂，其不是通过基因特异序列的存在而发挥作用。而且，基于多核苷酸的佐剂被认为以非特异方式调节免疫反应，并且它们的作用在接种位点起始，在那里与胞外受体相互作用以非特异方式增强免疫细胞的活性。在一些情况中，基于多核苷酸的佐剂被内化，由此它们通过与胞内受体相互作用来发挥它们的作用，类似地引起下游通路的活化，并共同地导致免疫细胞活性的增强以辅助免疫反应的产生。这些佐剂不直接影响特定基因的表达，所述基因被多核苷酸构建体靶向，如本文所考虑的。这些佐剂不直接与靶向基因的表达产物相互作用，它们也不含有与靶向基因的正义或反义序列相对应的序列。在一个实施方式中，组合物用于增强编码多肽的多核苷酸的体内表达。在其它实施方式中，多核苷酸可以不编码多肽，而可以是例如这样的多核苷酸，其包括或编码反义RNA或非多肽的其它分子。在一些实施方式中，组合物包含感兴趣的多核苷酸——任选可操作地连接至适合引导蛋白质由多核苷酸表达的调控序列(例如启动子)、脂质体和包括连续相疏水物质的载体。如通过ELISA测量，证明了在鼠类模型中，相对于悬浮在磷酸盐缓冲液中的质粒DNA，本专利技术的组合物可增加质粒DNA的多肽表达。如通过免疫荧光测量，还证明了在鼠类模型中，相对于悬浮在磷酸盐缓冲液、不完全弗氏佐剂(IFA)或在无油的脂质体中的质粒DNA，本专利技术的组合物增加质粒DNA的多肽表达。如本文所用术语“多核苷酸”包括任意长度(例如9、12、18、24、30、60、150、300、600、1500或更多个核苷酸)或链数(例如单链或双链)的核苷酸链。多核苷酸可以是DNA(例如基因组DNA或eDNA)或RNA(例如mRNA)或其组合。它们可以是自然发生的或合成的(例如化学合成的)。可预期的是，多核苷酸可在核苷酸链中含有一个或更多个含氮碱基、戊糖或磷酸基的修饰。这些修饰是本领域已知的并可以用于例如提高多核苷酸稳定性的目的。如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”意思是任何氨基酸链，而不管长度(例如4、6、8、10、20、50、100、200、500或更多个氨基酸)或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。两个术语可互换使用。本专利技术的组合物可用于在体内将各种多核苷酸输送至对象。在一些实施方式中，多核苷酸在对象中不被表达为蛋白质，而是编码例如反义RNA、干扰RNA、催化RNA或核酶。在一些实施方式中，多核苷酸编码在对象中体内表达的多肽。本专利技术不限本文档来自技高网...
【技术保护点】
组合物在制备用于在哺乳动物中表达多肽的药物中的应用，所述组合物包括：选自油或油包水乳状液的载体；脂质体；和包封在所述脂质体内的多核苷酸，所述多核苷酸编码所述多肽并且可操作地连接至在哺乳动物细胞中具有功能的启动子。
【技术特征摘要】
2007.09.27 US 60/975,602;2008.06.13 US 61/061,3031.组合物在制备用于在哺乳动物中表达多肽的药物中的应用，所述组合物包括：选自油或油包水乳状液的载体；脂质体；和包封在所述脂质体内的多核苷酸，所述多核苷酸编码所述多肽并且可操作地连接至在哺乳动物细胞中具有功能的启动子。2.根据权利要求1所述的应用，其中所述多核苷酸被插入表达质粒中。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物包括含有所述多核苷酸的细菌或病毒载体。4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其中所述多肽是抗原、抗体或抗体片段、酶、细胞因子、治疗蛋白、趋化因子、调控蛋白、结构蛋白、嵌合蛋白、核蛋白、转录因子、病毒蛋白、TLR蛋白、干扰素调控因子、血管生成抑制蛋白或血管生成蛋白、凋亡蛋白、Fcγ受体、造血蛋白、肿瘤抑制蛋白、细胞因子受体、或趋化因子受体、催化RNA或核酶。5.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其中所述多肽是抗原。6.根据权利要求1至5任一项所述的应用，其中所述组合物在仅一次施用后能够在所述哺乳动物中诱导可检测水平的所述多肽的表达。7.根据权利要求1至6任一项所述的应用，其中所述组合物能够在所述哺乳动物中以比(i)不含所述脂质体的相同组合物；(ii)不含选自油或油包水乳状液的所述载体的相同组合物；或(iii)不含所述脂质体和选自油或油包水乳状液的所述载体的相同组合物高至少7倍的水平表达所述多肽。8.组合物在制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·曼斯奥，M·卡尔卡达，G·M·韦尔，
申请(专利权)人：免疫疫苗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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