本发明专利技术公开了人类白细胞抗原基因分型的方法及其试剂。首先用PCR扩增待检测的基因组DNA的HLA-B和HLA-C位点基因；然后通过十二条测序引物对扩增产物进行测序反应，确定基因型；所述测序引物包括HLA-B外显子5、6、7测序引物和HLA-C外显子5、6、7测序引物。本发明专利技术通过加做非常规检测区的外显子测序，有效地解决了HLA高分辨基因分型时出现越来越多的模棱两可结果的问题。所获得的序列中无背景信号和杂峰；可导入商品化试剂配套的分析软件中，易于识别和结果判读。本发明专利技术的引物均可与商品化试剂盒同步扩增和测序，提高工作效率，明显降低试剂成本，从而对提高检测效率有着非常重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因分型的方法及其试剂，尤其涉及一种用于HLA-B、HLA-C位点5、6、 7外显子基因分型的方法及其试剂。
技术介绍
HLA复合体遗传区位于人类第6号染色体短臂上，全长4000kb，其功能与免疫反 应有关。HLA分子递呈抗原肽给T淋巴细胞识别，在适应免疫应答中起着极其重要的作用。 HLA基因也是人类极其重要的遗传结构，在器官移植免疫排斥、司法鉴定等领域有着非常重 要的意义。HLA基因分为I类、II类和III类。HLA-B、-C位点属I类基因。 截至2014年7月，国际免疫遗传頂GT/HLADatabase数据库公布的HLA-B、-C位 点的等位基因分别为3455和2529个。HLA基因测序分型技术是HLA基因分型的"金标准"。 目前，HLA-SBT基因测序分型技术被业内公认为器官移植前和造血干细胞移植前HLA高分 辨配型的最佳方法。临床实践表明，HLA等位基因匹配程度起关键作用，是影响移植器官长 期预后的重要因素。随着每个位点等位基因的数量逐年增多，模棱两可结果的比例也随之 增高，IMGT/HLADatabase中模棱两可等位基因组合的统计数据充分证实了这点。从单个 HLA位点来看，HLA-B和-C位点的模棱两可比例分别为91. 08%和97. 69%。HLA模棱两可等位基因组合形成的原理主要为两种：（1)是某一等位基因常规检 测区序列完全相同导致的，即差异碱基在常规检测区外(常规检测区外模棱两可)；（2)由于 PCR产物的杂合性，有时不同等位基因的组合可得到相同的杂合子序列，即检测区内杂合序 列一致(检测区内模棱两可)。 长期在使用的商品化试剂盒（HLA-B和-C位点常规检测区测序分型试剂盒，美国 AtriaGenetics公司）由于只提供了常规检测区第2、3和4外显子的正反向引物，故只能 检测HLA-A、-B和-C位点常规检测区即第2、3和4外显子的碱基序列。差异碱基在常规检 测区外的等位基因就成了模棱两可基因。例如，008:01/08:22的差异碱基在HLA-C位点 的第6外显子的1034碱基位上，因商品化试剂盒的常规检测区测序并不包括第6外显子的 测序，所以，008:01/08:22即成了模棱两可基因。008:01和008:22均是中国人群CWD (常见及确定的)等位基因。在发放临床移植配型报告时，必须将这两个基因明确化。以往， 所采用的PCR-SSP(聚合酶链式反应-序列特异性引物）法，由于新等位基因被发现的速度 很快，商品化的PCR-SSP试剂的更新滞后，有的新等位基因可能不能被涵盖和鉴定。而且， 某些阳性条带不够清楚或某些孔出现非特异性条带容易引起误判。因此，采用测序分型的 方法解决模棱两可势在必行。
技术实现思路
为解决上述商品化试剂盒检测结果模凌两可的问题，本专利技术的目的是提供一种能 精确分型的人类白细胞抗原基因分型的方法。 本专利技术的另一目的是提供该基因分型方法所用的试剂。 为达到上述目的之一，本专利技术采用以下技术方案： 人类白细胞抗原基因分型的方法，包括以下步骤： (1) 用PCR扩增待检测的基因组DNA的HLA-B和HLA-C位点基因； (2) 通过十二条测序引物对HLA-B和HLA-C扩增产物进行测序反应，确定基因型； 所述测序引物包括HLA-B外显子5、6、7测序引物和HLA-C外显子5、6、7测序引物；HLA-B外显子5、6、7测序引物及核苷酸位置为： 第五外显子正向测序引物B5F，其序列为：5'-GGGGATGAGGGGTCATATC-3'（SEQIDNo.1)，ntl851_ntl869; 第五外显子反向测序引物B5R，其序列为：5'-TGCTGCWTCCCAGTAATGA-3'（SEQIDNo.2)，nt2134_nt2152; 第六外显子正向测序引物B6F，其序列为：5'-AGGAGGTTCCTCTAAGATC-3'（SEQIDNo.3)，nt2424_nt2442; 第六外显子反向测序引物B6R，其序列为：5'-TGTCGCTGSCTGGAGTAGA-3'（SEQIDNo.4)，nt2623_nt2641; 第七外显子正向测序引物B7F，其序列为：5'-GGAGTGTGRAGGAGCTCAC-3'（SEQIDNo.5)，nt2543_nt2561; 第七外显子反向测序引物B7R，其序列为：5 ' -CTCAGGCTACAGAAAACAAC-3 '（SEQIDNo.6)，nt2849_nt2868; HLA-C外显子5、6、7测序引物及核苷酸位置为： 第五外显子正向测序引物C5F，其序列为：5'-GGTCAGGGCTGAGGCTTGG-3'（SEQIDNo.7)，ntl926-ntl944 ; 第五外显子反向测序引物C5R，其序列为：5 '-CCTGGGGCTTGAAACTCCC-3 '（SEQIDNo.8)，nt2145_nt2163 ; 第六外显子正向测序引物C6F，其序列为：5'-TGGGGTCTGGGTTTTCTTG-3'（SEQIDNo.9)，nt2119_nt2137 ; 第六外显子反向测序引物C6R，其序列为：5 ' -GGAGATGTGGGACAAGAGG-3 '（SEQIDNo.10)，nt2620_nt2638 ; 第七外显子正向测序引物C7F，其序列为：5'-CCCACATCTCCTGCGGGCT-3'（SEQIDNo.11)，nt2628_nt2646; 第七外显子反向测序引物C7R，其序列为：5' -CAGCTGTCTCAGGCTACAG-3'（SEQIDNo.12)，nt2885_nt2903。 进一步地，步骤（2)所述HLA-B扩增产物有两条产物片段，长度分别为1. 3kb和 1. 5kb〇 进一步地，步骤（2)所述HLA-C扩增产物有两条产物片段，长度分别为1. 3kb和 1. 5kb〇 进一步地，步骤（2)所述测序反应的体系为： 测序引物（10pM) 0. 2yL DNA测序模板 2. 0μL 5XBigDye缓冲液 1· 875μL BigDye1· 1 或 3· 1 0. 5μL ddH20 5. 425μL〇 进一步地，步骤（2)所述测序反应的循环参数为：96°C，20s;50°C，30s;60°C， 2min;25个循环后保持4°C。 人类白细胞抗原基因分型的试剂，包括以下测序引物： HLA-B外显子5、6、7测序引物： 第五外显子正向测序引物B5F，其序列为：5' -GGGGATGAGGGGTCATATC-3' ； 第五外显子反向测序引物B5R，其序列为：5' -TGCTGCWTCCCAGTAATGA-3' ； 第六外显子正向测序引物B6F，其序列为：5' -AGGAGGTTCCTCTAAGATC-3' ； 第六外显子反向测序引物B6R，其序列为：5' -TGTCGCTGSCTGGAGTAGA-3' ； 第七外显子正向测序引物B7F，其序列为：5' -GGAGTGTGRAGGAGCTCAC-3' ； 第七外显子反向测序引物B7R，其序列为：5' -CTCAGGCTACAGAAAACAAC-3' ； HLA-C外显子5、6、7测序引物： 第五外显子正向测序引物C5F，其序列为：5' -G本文档来自技高网...
【技术保护点】
人类白细胞抗原基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用PCR扩增待检测的基因组DNA的HLA‑B和HLA‑C位点基因；（2）通过十二条测序引物对HLA‑B和HLA‑C扩增产物进行测序反应，确定基因型；所述测序引物包括HLA‑B外显子5、6、7测序引物和HLA‑C外显子5、6、7测序引物；HLA‑B外显子5、6、7测序引物：第五外显子正向测序引物B5F，其序列为：5’‑GGGGATGAGGGGTCATATC‑‑3’；第五外显子反向测序引物B5R，其序列为：5’‑TGCTGCWTCCCAGTAATGA‑‑3’；第六外显子正向测序引物B6F，其序列为：5’‑AGGAGGTTCCTCTAAGATC‑3’；第六外显子反向测序引物B6R，其序列为：5’‑TGTCGCTGSCTGGAGTAGA‑3’；第七外显子正向测序引物B7F，其序列为：5’‑GGAGTGTGRAGGAGCTCAC‑3’；第七外显子反向测序引物B7R，其序列为：5’‑CTCAGGCTACAGAAAACAAC‑3’；HLA‑C外显子5、6、7测序引物：第五外显子正向测序引物C5F，其序列为：5’‑GGTCAGGGCTGAGGCTTGG‑‑3’；第五外显子反向测序引物C5R，其序列为：5’‑CCTGGGGCTTGAAACTCCC‑‑3’；第六外显子正向测序引物C6F，其序列为：5’‑TGGGGTCTGGGTTTTCTTG‑3’；第六外显子反向测序引物C6R，其序列为：5’‑GGAGATGTGGGACAAGAGG‑3’；第七外显子正向测序引物C7F，其序列为：5’‑CCCACATCTCCTGCGGGCT‑3’；第七外显子反向测序引物C7R，其序列为：5’‑CAGCTGTCTCAGGCTACAG‑3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王大明，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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