一种特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体制造技术

本发明专利技术公开了一种棒曲霉素的寡核苷酸适配体。通过基于氧化石墨烯的指数富集配体系统进化技术，获得了能够特异识别棒曲霉素的单链寡核苷酸适配体，该适配体可以通过标记功能基团等转为报告适配体，用于检测棒曲霉素，该适配子序列在准确、快速检出食品中的棒曲霉素具有广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体
本专利技术涉及生物
，具体涉及到利用一种SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一种与棒曲霉素高特异性和高亲和力的核酸适配体，为该核酸适配体在快速检测棒曲霉素提供基础。
技术介绍
棒曲霉素(Patulin)是由青霉属、曲霉属、丝衣霉属产生的真菌代谢产物，主要在苹果及其制品中常见。棒曲霉素对热稳定，100℃加热15分钟仍然不能破坏其结构，且在酸性溶液及有机溶剂中能长期保存。棒曲霉素曾因为其抑制多种菌生长而被用作抗生素，它具有引起抽搐、肠道出血、肺部出血、肾脏损害等急性毒性，同时具有神经毒性、免疫毒性、基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前检测棒曲霉素的方法有：薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法(LC)、反相高效液相色谱(reveresed-phaseHPLC)、色谱联用技术(GC/MS,LC/MS)、酶联免疫法(ELISA)等。这些方法检出限低、精密度高，但操作复杂、检测成本高。构建一种快速、简单、低成本的棒曲霉素检测方法有重要意义。适配体是一种能以高亲和力与各靶分子特异结合的单链寡核苷酸，一般通过指数富集配体的系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)筛选得到。适配体以其从体外制备、高亲和性、高特异性、获得方便、易修饰等的优势引起了国内外科研人员的广泛研究。目前对于小分子物质的适配体筛选方法主要有亲和层析法、磁珠法、毛细管电泳法等，主要通过将靶分子活化后固定在固载物质上，从而将与靶分子结合的适配体分离出来。这种方法对靶分子结构有较高的要求，即其结构中含有易活化基团，并且活化之后对原结构产生较小的变化和影响。氧化石墨烯可以通过π-π堆叠作用吸附ssDNA，但不易吸附与靶分子结合而产生构象折叠后的ssDNA，可以用来分离与靶分子结合的适配体。在专利技术中，将氧化石墨烯作为SELEX筛选的分离方法，避免改变小分子棒曲霉素的结构，避免活化将其固定于载体上，只需直接利用氧化石墨烯对ssDNA的强吸附作用，将未与靶标结合的ssDNA去除，实现对直接对天然的棒曲霉素的适配体的筛选。获得高亲和性高特异性与棒曲霉素结合的寡核苷酸适配体后，可将其化学修饰，用于发展简单便捷的检测棒曲霉素的方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种对完整靶分子检测方法，特别涉及一种能特异结合棒曲霉素的适配体，为发展快速、便捷检测棒曲霉素的方法奠定基础。本专利技术方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以氧化石墨烯为分离方法，无需将靶分子固定在载体上，以棒曲霉素完整的结构为靶标，筛选获得与靶分子高亲和性特异结合的适配体。最终通过12轮的筛选，获得与棒曲霉素高亲和性高特异性结合的最佳寡核苷酸适配体。本专利技术的优点：与抗体和酶相比，避免了传统抗体制备中动物实验过程，而直接从体外文库中选择；适配体对体外筛选靶分子显示出高特异性和亲和力，目标范围广；获得方便，合成的重现性好，通过化学合成和修饰可以增强其稳定性；化学性质更稳定，保存时间长；避免将小分子靶标固定在载体上；避免小分子靶标的结构变化。附图说明图1是PAT-11寡核苷酸适配体的模拟二级结构图。图2是PAT-11寡核苷酸适配体的饱和结合曲线图。图3是PAT-11寡核苷酸适配体的特异性试验结果。具体实施方式：以下是通过SELEX技术筛选特异结合棒曲霉素的核酸适配体的进一步说明。1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机单链DNA(ssDNA)文库：5′-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT(N40)GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3′，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量为1014以上；上游引物Ⅰ：5′-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3′；下游引物Ⅱ：5′-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3′，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃贮存备用。2、ssDNA的制备及纯化反应体系为：模板DNA5μL，FAM标记上游引物1μL(20mM)，磷酸化下游引物0.5μL(20mM)，dNTPmix(25mM)0.5μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，灭菌超纯水37.5μL，Taq酶0.5μL，总体积为50μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸20s；循环25次；最后72℃延伸2min。PCR扩增后得到的产物通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳确认电泳条带是否正确，是否单一。取条带正确且带形单一的PCR产物溶液，用DNA纯化试剂盒(Generay)进行纯化，溶于灭菌超纯水。再加入1/10体积的10×lambda酶切反应缓冲液混合均匀，在37℃下反应40min，再75℃水浴10min使酶失活停止反应。使用含7M尿素的变性8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，确认电泳条带是否正确，是否单一。将条带位置正确且带形单一的酶切产物汇集在一个离心管中，等体积的酚:氯仿:异戊醇(V:V:V＝25:24:1)混合液，在旋涡混合器上混匀管内容物使之呈乳状，2000rpm、4℃离心5min，再8000rpm、4℃离心1min，吸取上清。在得到的上清液中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)溶液及2倍体积的无水乙醇，漩涡震荡仪充分混匀30s后置于-20℃冰箱内过夜。取出后，13000rpm，4℃离心15min，离心管底部出现淡黄色沉淀，弃上清，加入4℃预冷的70％乙醇上下颠倒洗涤，再14000rpm、4℃离心5min后弃上清，打开盖子将沉淀置于50℃烘箱至烘干，溶于灭菌TE缓冲液中，通过One-drop分光光度计测定ssDNA浓度。3、GO筛选方法本专利技术利用氧化石墨烯对ssDNA强吸附作用来实现去除未能与靶标结合的ssDNA。实验中，将靶分子棒曲霉素溶于乙酸乙酯，配为0.1mg/ml的溶液存于-20℃，每次取出后用氮气吹干，再加入试剂使用。首轮孵育时，加入随机ssDNA文库2nmol，其余每轮ssDNA文库(由上一轮制备)加入量为200pmol，每轮靶标加入量为2nmol。每一轮孵育体系为300μl，在BindingBuffer(50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，2mMMgCl2)中孵育，25℃孵育一段时间后，加入GO进行吸附30min，再14000rpm，10min离心取上清。每一轮孵育后所得到上清液作为模板进行PCR扩增，扩增所得DNA经过纯化、酶切、纯化得到ssDNA作为下一轮筛选的文库。富集到一定程度后，加入类似毒素黄曲霉毒素B1、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米赤霉烯酮进行反筛，以去除低特异性的ssDNA。即先将ssDNA与反筛分子进行孵育2h，加入氧化石墨烯GO，则未与反筛分子结合的ssDNA被吸附到GO表面。接下来清洗GO，再将其重悬与BB中，加入棒曲霉素，孵育2h。孵育后离心收集孵育液，进行PCR扩增，纯化，制备单链，作为下一轮筛选的单链文库。4、克隆和测序将第十二轮富集的ssDNA文库，PCR扩增为双链，送上海生物工程本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体，具有序列表1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.特异性识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体，该适配体的序列如序列表中序列1所示。2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，所述序列为人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。3.特异性识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体，该适配体为在权利要求1所述适配体序列的5’端或3’端连接或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，张维潇，段诺，吴世嘉，夏雨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32