一种石蒜中加兰他敏的提取方法技术

本发明专利技术提供了一种石蒜中加兰他敏的提取方法，包括步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasil100-5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-磷酸缓冲液(17：83)，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm；磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7.02；步骤二、标准曲线的制备：按步骤一色谱条件建立回归方程；步骤三、加兰他敏的提取：称取石蒜粉末2.0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH＝4.5的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液，采用色谱测定，计算石加兰他敏得率。本发明专利技术提取成本低、提取时间短，工艺简单，对环境无污染，提取得率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种石蒜中加兰他敏的提取方法
本专利技术涉及一种加兰他敏提取方法，特别涉及一种石蒜中加兰他敏的提取方法。
技术介绍
石蒜(Lycorisradiate.Herb)是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)的多年生草本植物，主要分布在亚洲，我国有17种，在我国湖南、湖北、江苏、浙江、福建等省均有分布。石蒜属植物具有较高的观赏价值，被誉为“中国郁金香”，石蒜鳞茎富含淀粉，如将其磨碎后用大量水淘洗，脱毒后食用，味如糯米粉，《救荒本草》中记载，可将其炒熟，水浸过食。石蒜性味辛、甘、温，具有消肿、杀虫的作用，其所含丰富的生物碱也得到广泛应用，尤其是加兰他敏，随着人口老龄化的严重加剧，阿尔茨海默病(AD)造成的疾病负担日益增加，而石蒜鳞茎中的加兰他敏因毒副作用小、疗效显著的优势是目前被美国FDA认可的抗AD药物之一，国内外需求量巨大；其次，它还可用于闭角型青光眼、术后肠肌麻痹、脊髓灰质炎引起的瘫痪、重症肌无力的治疗。石蒜是加兰他敏原料药的植物来源之一，但含量低，其提取通常采用溶剂的抽提方法，提取较为耗时，并且资源浪费、环境污染严重，因此提供一种新的加兰他敏的提取方法就显得尤为重要。
技术实现思路
为解决上述现有技术的问题，本专利技术提出一种石蒜中加兰他敏的提取方法，为达到上述目的，本专利技术的技术方案为：一种石蒜中加兰他敏的提取方法，包括如下步骤：步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasil100-5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-磷酸缓冲液(17∶83)，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm；磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7.02；步骤二、标准曲线的制备：分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成1.0mg/mL的加兰他敏及1.0mg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mL加兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中配成质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/mL的混合标准溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件测定，得回归方程；步骤三、加兰他敏的提取：称取石蒜粉末2.0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH＝4.5的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液，采用色谱测定，计算加兰他敏得率。步骤三中，所述加兰他敏得率的计算公式为式中：c为加兰他敏的质量浓度/(mg/mL)；V为提取液定容体积/mL；m0为石蒜粉末的质量/mg。步骤三中加兰他敏的提取条件为：浸提温度50℃、浸提时间2.0h、加酶量4％、提取剂选取pH＝4.5的水溶液。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术采用pH为4.5的水作为提取溶剂，提取溶剂中加入4％的纤维素酶与果胶酶的复合酶，通过浸提法得到加兰他敏提取得率为0.0294％。该工艺石蒜加兰他敏提取成本低、提取时间短，工艺简单，对环境无污染，提取得率较高。附图说明图1酶种类对得率的影响，其中1纤维素酶、2半纤维素酶、3果胶酶。图2pH对得率的影响。图3酶用量对得率的影响。图4浸提时间对得率的影响。图5温度对得率的影响。图6料液比对得率的影响。具体实施方式下面结合具体附图及试验例对本专利技术方法做进一步详细说明：1材料与方法1.1材料与试剂石蒜于2012年3月采自湖南省怀化市沅陵县官庄。加兰他敏标准品(纯度＞98％)中国食品药品鉴定研究院；石蒜碱标准品(纯度＞98％)上海金穗生物科技有限公司；纤维素酶淮安市百麦绿色生物能源有限公司果胶酶如吉生物科技甲醇、乙腈(均为色谱纯)美国Tedia公司；浓硫酸、磷酸二氢钾、三乙胺均为分析纯。1.2仪器与设备Agilent1260高效液相色谱仪美国Agilent公司；数显水浴锅金坛富华仪器有限公司。1.3方法1.3.1色谱条件色谱柱：Kromasil100-5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-磷酸缓冲液(17∶83)，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm。磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7.02。1.3.2标准曲线的制备分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成1.0mg/mL的加兰他敏及1.0mg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mL加兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中配成质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/mL的混合标准溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件测定，得回归方程。1.3.3加兰他敏的提取称取石蒜粉末2.0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH＝4.5的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液。采用色谱测定，计算加兰他敏得率。式中：c为加兰他敏的质量浓度/(mg/mL)；V为提取液定容体积/mL；m0为石蒜粉末的质量/mg。1.3.4提取工艺优化1.3.4.1单因素试验按1.3.3节方法，分别考察酶的种类、提取剂pH、酶用量、浸提时间、浸提温度和料液比对加兰他敏得率的影响，确定各个单因素的最佳水平。1.3.4.2正交试验在单因素试验的基础上，选取浸提温度(A)、浸提时间(B)、酶用量(C)、提取剂pH(D)4项考察因素，每个因素选取3个水平，以加兰他敏得率为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验。2结果与分析2.1加兰他敏的检测以1.3.1节所示色谱条件进行检测，加兰他敏的出峰时间约在10.1min。以标准品的含量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。加兰他敏的回归方程：Y＝8968.6X+4.5795，r＝0.9999。取同一个试样，在上述色谱条件下，连续进样6次，经计算加兰他敏峰面积的相对标准差(RSD)为1.35％。取同一个试样，在上述色谱条件下，每隔2h进样1次，共进样6次，经计算加兰他敏峰面积的相对标准差(RSD)分别为1.66％，这说明该检测方法精密度良好，方法稳定可靠。2.2单因素试验2.2.1酶的筛选以pH＝4.5的水为提取剂在料液比1∶10，加入3％的不同酶(1纤维素酶、2半纤维素酶、3果胶酶、4纤维素酶+半纤维素酶、5纤维素酶+果胶酶、6半纤维素酶+果胶酶、7纤维素酶+半纤维素酶+果胶酶)50℃浸提2.0h，离心，过滤，HPLC检测。考察不同酶种类对加兰他敏得率的影响，结果见图1。图2显示了各种酶对加兰他敏提取效果的影响，纤维素酶和果胶酶的的混合酶效果最好。2.2.2pH的影响加入3％的纤维素酶和果胶酶的混合酶，按料液比1∶10，分别加入pH＝1.5、3、4、4.5、5、6、7.5的水溶液，50℃浸提2.0h，离心，过滤，HPLC检测。考察pH对加兰他敏得率的影响，结果见图2。由图3可知在1～4.5范围内加兰他敏的得率随着pH的升高而提高，但pH超过4.5后得率随pH的升高而降低，最佳pH为4.5。2.2.3酶用量的影响加入一定量的纤维素酶和果胶酶的混合酶，按料液比1∶10，加入pH＝4.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石蒜中加兰他敏的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasil100‑5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈‑磷酸缓冲液(17：83)，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm；磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7.02；步骤二、标准曲线的制备：分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成1.0mg/mL的加兰他敏及1.0mg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mL加兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中配成质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/mL的混合标准溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件测定，得回归方程；步骤三、加兰他敏的提取：称取石蒜粉末2.0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH＝4.5的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液，采用色谱测定，计算加兰他敏得率。

【技术特征摘要】
1.一种石蒜中加兰他敏的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasil100-5C18反相柱250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-磷酸缓冲液17:83，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm；磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7.02；步骤二、标准曲线的制备：分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成1.0mg/mL的加兰他敏及1.0mg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mL加兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中配成质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/mL的混合标准溶液，用0.45μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：田春莲，王鹏，刘小攀，肖卓炳，
申请(专利权)人：吉首大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43