【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物保护的生物防治，具体指一种猕猴桃溃疡病生防菌株淡紫褐链霉菌wk-1及应用该菌株防治猕猴桃溃疡病的方法。
技术介绍
1、猕猴桃（ actinidia lindl）是隶属猕猴桃科猕猴桃属的多年生藤本植物，别称毛桃、羊桃、奇异果（kiwifruit）。其果实含有丰富的膳食纤维、维生素、矿质元素、氨基酸以及生物活性物质，尤其vc含量高（100 g鲜果肉中达90~420 mg），素有“水果之王”的美誉；猕猴桃可以鲜食，也可加工成果酱、果汁等，还有重要的医疗保健价值，具有广阔的市场前景。
2、近些年来，猕猴桃产业已在全球30多个国家迅猛发展，栽培总面积约20万公顷，产量达240万吨，其中中国猕猴桃栽培面积和产量最大，分别占世界份额的53%和38%，意大利次之，新西兰位列第三。随着猕猴桃种植面积逐年增加和生产规模逐渐扩大，猕猴桃病害问题也日益突显。其中最典型的是猕猴桃细菌性溃疡病，该病由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（ pseudomonas syringae pv. actinidiae）引起，主要危害猕猴桃的主干、枝蔓和叶片等，具有传播迅速、致病性强、防治难度大等特点，极易短期内造成树体大面积死亡。
3、目前，控制猕猴桃溃疡病的措施除了科学规范的农业管理外，主要包括优良抗性品种选育、化学防治和生物防治，其中生物防治具有环境友好、人畜安全、可持续性、对病原菌特异性强等特征，符
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题就是克服现有技术的不足，提供一种猕猴桃土著内生细菌，该细菌是猕猴桃溃疡病致病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，运用该菌株能高效防治猕猴桃溃疡病；同时，本专利技术还提供了运用该菌株生物防治猕猴桃溃疡病的方法。
2、本专利技术人在湖南湘西地区猕猴桃种植园采样点，采集健康的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株枝条和叶片，放入冰盒中带回实验室，从该样品中分离、筛选得到1株抑制猕猴桃溃疡病致病菌生长的内生细菌菌株，即丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，经鉴定后命名为淡紫褐链霉菌wk-1（ streptomyces enissocaesilis wk-1），并进行了保藏，保藏编号：cgmcc no. 27261，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
3、所述菌株wk-1的分离和筛选步骤包括：
4、（1）以湖南湘西地区猕猴桃溃疡病频发的果园为采样点，采集健康的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株的枝条和叶片，放入冰盒中带回实验室备用。将枝条和叶片样品进行表面消毒，剪切成合适大小放入灭菌后的研砵中，加入5-10 ml无菌水进行研磨。静置5-10min，吸取上层液体，依次进行10-1倍、10-2倍、10-3倍梯度稀释；分别取0.1 ml稀释液涂布于lb培养基固体平板，每个稀释度重复3次，于28℃倒置培养。
5、（2）待涂布的平板上长出单菌落，挑取不同形态的菌落，采用四区划线法分别接种于lb固体培养基上培养；重复纯化3代，转接于lb固体培养基斜面试管培养后4℃保存。
6、（3）将猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种接种至lb液体培养基培养24 h，吸取菌液涂布于lb固体培养基平板中备用。挑取分离的内生细菌单菌落点种于该平板上，每个平板接种3~4个位点，于28℃恒温培养，观察抑菌情况，产生抑菌圈的即为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株。
7、（4）将初筛的拮抗菌株发酵培养，离心后吸取200 ml发酵液，移入涂布有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种平板的牛津杯中，观察牛津杯周围抑菌圈的大小，筛选拮抗效果强的菌株。基于形态学和16s rrna基因序列分析鉴定菌种。
8、获得的拮抗丁香假单胞菌猕猴桃致病变种效果优良的内生细菌即为猕猴桃溃疡病的生防菌株，可用于猕猴桃溃疡病的生物防治，其步骤为：
9、（1）将上述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株接种至lb液体培养基中进行培养，获得发酵种子液；
10、（2）将发酵种子液接种至lb液体培养基进行扩大培养，得到发酵培养液。
11、（3）将发酵培养液配成一定浓度稀释液（包含菌体，其浓度≥0.8×103 cfu/ml，即每毫升细菌菌落总数大于等于800个），对准猕猴桃植株喷洒，即可实现猕猴桃溃疡病的有效防治。
12、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
13、本专利技术提供了一种新的猕猴桃溃疡病生防菌株wk-1，是猕猴桃土著内生菌株，即猕猴桃溃疡病致病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，经鉴定后命名为淡紫褐链霉菌wk-1（ streptomyces enissocaesilis wk-1）。
14、该菌株是从采集的猕猴桃植株枝条中分离纯化获得的内生细菌，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种有很强的抑制作用，能够明显抑制猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的生长与繁殖，可有效防治猕猴桃溃疡病发生，为猕猴桃溃疡病生物防治提供了新的微生物种质资源。
15、由于该菌株为猕猴桃内生细菌，可与植物组织互利共生，受外界环境因子干扰小，性能稳定，喷湿方便，防治猕猴桃溃疡效果显著，为猕猴桃溃疡的防治提供了一条环保、简洁、有效的方法，利于环境保护和有机猕猴桃的生产。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1，属放线菌，鉴定为淡紫褐链霉菌（Streptomyces enissocaesilis），是猕猴桃溃疡病的生防菌株，也是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，保藏编号：CGMCC NO. 27261，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述淡紫褐链霉菌菌株Wk-1防治猕猴桃溃疡病的方法，其特征在于包括以下几个步骤：
【技术特征摘要】
1.一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株wk-1，属放线菌，鉴定为淡紫褐链霉菌（streptomyces enissocaesilis），是猕猴桃溃疡病的生防菌株，也是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，保藏编号：cgmcc no. 27261...
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