本发明专利技术公开了一种用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及其生产的石蒜凝集素，是以石蒜鳞茎为原料，经特定的工艺提取并纯化而得到的一种单一蛋白带的石蒜凝集素纯品，表观分子量48KD，是由四个分子量相同的亚基组成的蛋白质，一种无定形粉末，石蒜凝集素含量高达90％，其工艺步骤依次为：(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、(9)第一次透析除盐、(10)电泳色谱分离、(11)分子筛层析、(12)洗脱、(13)第二次透析除盐、(14)真空浓缩、(15)真空干燥。本发明专利技术方法提供了一种既可以提取石蒜凝集素又可以提取石蒜多糖、石蒜胶、还可以提取分离石蒜总生物碱的方法，工艺简单，节能降耗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用石蒜属植物鳞茎提取并纯化有效成分的方法，具体地说是用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及用该方法生产的石蒜凝集素。
技术介绍
石蒜(分corl s ra dl a to)属于石蒜科植物，别名老鸦蒜、蒜头草、嶂螂花；多年生草本，鳞茎呈椭圆形，内含丰富的凝集素(Lycori s radi a toAgglutinin，简称LRA) 石蒜为多年生草本球茎花卉，品种众多，有红花、黄花、白花等多种类型。在植物分类学上属于单子叶植物石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris. herb).石蒜属植物在世界分布约20种，我国就有15种，占绝对优势，分布12省、市、自治区，秦岭以南至长江流域和西南地区均有野生分布，集中分布于长江中下游地区，其中安徽、江苏、浙江三省植物资源分布最为丰富，蕴藏量最大.石蒜的鳞茎中含有多种生物碱，主要有高石标碱(Homolycorine)、石蒜伦碱 (Lycorenine)、多花水仙碱(Tazett ine)、石蒜胺碱(Lycoramine)、石蒜碱(Lycorine) 石蒜碱(Pseudolycorine)和雪花莲胺碱(加兰他敏Galanthamine)等.此外还淀粉约 20% -40% ；又含有两种有抑制植物生长和抗癌作用的成分石蒜西定醇(Lycoridinol)、石蒜西定(Lycoricidine).叶和花瓣中含有糖类和糖甙.鳞茎中含有胶类物质，可以作为阿拉伯胶的替代品，此外石蒜的鳞茎还有较多的石蒜凝集素(Lycoris radiata agglutinin. LRA).植物凝集素在免疫学、化学、生物学以及临床医学方面很早就得到了广泛的运用。 在植物抗病方面也有较好的运用前景。对凝集素与肿瘤以及机体许多疾病的关系的研究也引人入胜，尤其是近年来凝集素作为特异性导向药物及抗爱滋病病毒的研究结果都为凝集素的研究指出了更广泛的领域。石蒜凝集素属于石蒜科凝集素，这类凝集素虽不及豆科类的种类多，但其日益显著的作用却越来越受到人们的重视.四川大学生命科学学院硕士学位论文《石蒜凝集素的纯化、性质及构象研究》，对石蒜凝集素的制备纯化有简单的介绍，由于该论文主要是以研究为目的，虽然某些工艺步骤与本专利技术相同，但其工艺步骤和工艺条件都很简单，石蒜凝集素的含量只有60%左右，产品质量不高。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于以石蒜属植物的鳞茎为原料，经提取、加工纯化而得石蒜凝集素，含量在90%以上，提取率在80%以上的的提取纯化方法，而且根据本方法提供的工艺， 可以将生产石蒜凝集素过程中的废液和废渣用生产乙醇、石蒜多糖、石蒜胶和石蒜生物总碱，达到石蒜鳞茎的综合利用。本专利技术的另一目的是利用本生产方法生产出一种单一蛋白带的，表观分子量为48KD，亚基分子量为12KD，四个分子量相同的亚基组成的石蒜凝集素(Lycoris chinensis agglutinin, LCA)纯品·是一种不定形粉末，本专利技术以石蒜属植物鳞茎为原料，经加工提取而得到的石蒜凝集素，专利技术产品可作医药研究和医药产品开发，还可应用于保健食品添加剂.本专利技术的工艺步骤依次为(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、第一次透析除盐、(10)电泳色谱分离、(11)分子筛层析、(12)洗脱、(13)第二次透析除盐、(14)真空浓缩、(15)真空干燥.本专利技术与工艺步骤相应的具体操作条件为1.具体操作条件为(1).原料制备将新鲜石蒜鳞茎去根、除杂、清洗干净、去黑皮，切片得新鲜原料， 亦可用鳞茎干粉或干片为制取石蒜凝集素的干原料；(2).打浆将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料；(3).第一次离心分离浆状原料用离心机经3500转/分离心分离，得离心分离液 1和离心固相1 ；(4).酶解浸提离心固相1加入4倍离心固相重的生理盐水分两次浸提，生理盐水中含植物复合酶0. 05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，浸提时间为45小时，浸提温度为常温；(5).第二次离心分离浸提完成后都用离心机在3500转/分离心分离，得离心分离液2和离心固相2，离心固相2用于生产乙醇；(6).合并离心分离液1和离心分离液2。(J).分级沉淀在合并后的离心液中逐步加入饱和硫酸铵溶液，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0. 43倍重至2. 4倍重的沉淀，即当饱和硫酸铵溶液加入量为离心液 0. 43倍重前和饱和硫酸铵溶液加入量为离心液2. 4倍重后的沉淀皆不取；(8).第三次离心分离，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0. 43倍重至2. 4倍重的沉淀经管式离心机在转速为3500转/分离心分离得离心液3和离心固相3 ；离心液3 用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱。保留离心固相3(9).第一次透析除盐将离心固相3放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐， 用氯化钡溶液至检不出硫酸根离子为终点，得石蒜凝集素粗品透析袋截留分子量彡10KD, IOKD = 10000D (道尔顿) (10).电泳色谱分离将石蒜凝集素粗品溶于用0. 02mol/L的NaAC_HAC，pH4. 5的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室、冲洗室、和进样室，然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品.吸附缓冲液20mMNaAC-HAC, pH4. 5，电流强度 I = 60Ma.洗脱缓冲液20mM Tris-HCl, pH 8. 5 ；洗脱缓冲液，流强度I = 40Ma.(11).分子筛层析将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Sephacryl S-200分子筛，平衡kphacryl S-200分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；(12).洗脱洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是1. 0-1. 5ml/min,收集活性部分，活性的检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性.(13).第二次透除盐将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液透析袋截留分子量彡10KD, IOKD = 10000D (道尔顿)(14).真空浓缩将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为-0. 085MPa，浓缩温度为35_40°C得浓缩样品(15).真空干燥将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为-0. 085MPa，干燥温度为常温，得不定形粉末(16).包装将得到的不定形粉末经包装得到含石蒜凝集素90%的产品。当用石蒜鳞茎干粉或干片作为制备石蒜凝集素的干原料时，工艺步骤C3)第一次离心分离和工艺步骤(6)合并第一次离心分离液1和第二次离心分离注液2两步骤去掉， 简化为14步.上述电泳色谱分离所用篮胶亲和介质是指琼脂糖亲和介质，通常简称为蓝胶，它是一种染料亲和介质，其配基(蓝色染料Cikicron Blue F3GA)是一种多芳香环的磺化物， 具有与NAD+相似的空间结构，能与各本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法，是以石蒜属植物鳞茎为原料，经提取纯化而得到的石蒜凝集素，其工艺步骤依次为：（１）原料制备、（２）打浆、（３）第一次离心分离、（４）浸提、（５）第二次离心分离、（６）合并离心分离液１和２、（７）分级沉淀、（８）第三次离心分离、（９）第一次透析除盐、（１１）分子筛层析、（１２）洗脱，其特征在于增加步骤（１０）电泳色谱分离，（１３）第二次透析除盐，（１４）真空浓缩，（１５）真空干燥，与工艺步骤相应的工艺条件和具体操作为：（１）．原料制备：将新鲜石蒜鳞茎去根、除杂、清洗干净、去黑皮，切片得新鲜原料，亦可用鳞茎干粉或干片为制取石蒜凝集素的干原料；（２）．打浆：将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料；（３）．第一次离心分离：浆状原料用离心机经３５００转／分离心分离，得离心分离液１和离心固相１；（４）．酶解浸提：离心固相１加入４倍离心固相重的生理盐水分两次浸提，生理盐水中含植物复合酶０．０５ｍｌ／ｌ，植物复合酶的浓度为１０５０００ｕ／ｍｌ，浸提时间为４－５小时，浸提温度为常温；（５）．第二次离心分离：浸提完成后都用离心机在３５００转／分离心分离，得离心分离液２和离心固相２，离心固相２用于生产乙醇；（６）．合并离心分离液１和离心分离液２；（７）．分级沉淀：在合并后的离心液中逐步加入饱和硫酸铵溶液，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液０．４３倍重至２．４倍重的沉淀，即当饱和硫酸铵溶液加入量为离心液０．４３倍重前和饱和硫酸铵溶液加入量为离心液２．４倍重后的沉淀皆不取；（８）．第三次离心分离，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液０．４３倍重至２．４倍重的沉淀经管式离心机在转速为３５００转／分离心分离得离心液３和离心固相３；离心液３用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱，保留离心固相３；（９）．第一次透析除盐：将离心固相３放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐，用氯化钡溶液至检不出硫酸根离子为终点，得石蒜凝集素粗品，透析袋截留分子量≥１０ＫＤ，１０ＫＤ＝１００００Ｄ（道尔顿）（１０）．电泳色谱分离：将石蒜凝集素粗品溶于用０．０２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡＣ－ＨＡＣ，ｐＨ４．５的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室、冲洗室、和进样室，然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室，开始电泳吸附．电泳吸附过程持续约６０分钟之后进行１５分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品，吸附缓冲液：２０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ，ｐＨ４．５，电流强度Ｉ＝６０Ｍａ，洗脱缓冲液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８．５；洗脱缓冲液，流强度Ｉ＝４０Ｍａ，（１１）．分子筛层析：将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００分子筛，平衡Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；（１２）．洗脱：洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是１．０－１．５ｍｌ／ｍｉｎ，收集活性部分，活性的检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性．（１３）．第二次透析除盐：将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液透析袋截留分子量≥１０ＫＤ，１０ＫＤ＝１００００Ｄ（道尔顿）（１４）．真空浓缩：将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为－０．０８５ＭＰａ，浓缩温度为３５－４０℃得浓缩样品（１５）．真空干燥：将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为－０．０８５ＭＰａ，干燥温度为常温，得不定形粉末。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉群，石贵阳，陈光强，刘涛，
申请(专利权)人：贵州芊芊园艺新技术发展公司，
类型：发明
国别省市：52
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