一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针制造技术

一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，属于核酸检测领域。具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针：用于特异性结合芽孢杆菌属的16SrRNA的分析探针、用于结合在载体上并与分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与分析探针特异性结合的信号探针。分析探针具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；捕获探针具有如SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列，具有生物素标记；信号探针具有如SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列，在5?端有异硫氰酸(FITC)标记。在每毫升培养液B.subtilis菌体浓度在1.33×102-2.13×105范围内与检测信号强度线性相关，R?=0.99741，而且特异性好、灵敏度高、稳定性高、定性定量，可应用到白酒等传统发酵生产过程中芽孢杆菌属的实时监测。

【技术实现步骤摘要】
一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针
本专利技术一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，具体是针对传统发酵（白酒、酱油、醋等发酵）中芽孢杆菌属（Bacillus）实现定性与定量检测的特异性检测探针，属于核酸检测领域。
技术介绍
芽孢杆菌属细菌能在高温下生长，需氧或兼性厌氧，因此在白酒酿造过程中高温厌氧的特殊环境中芽孢杆菌能大量繁殖，并且芽孢杆菌具有一定的水解蛋白质和淀粉的能力，因此芽孢杆菌是白酒酿造过程中的优势菌种，且对于白酒独特风味形成有重要的贡献。因此，研究芽孢杆菌属在白酒发酵过程中的变化规律对于指导白酒生产有重要意义。由于白酒等传统发酵过程是多种微生物混合发酵的结果，研究特定属种的变化规律，需要定性定量的检测方法，目前常用平板分离，PCR技术、变性梯度电泳、测序等技术，各个方法均具有一定的优点和局限性，例如平板分离耗时耗力，仅能分析可培养微生物，定时定量PCR技术价格昂贵，对DNA纯化效率有很高的要求，重复性难等。国内有报道用改进的夹心杂交方法对海水中藻类、浸矿中功能菌进行定性定量检测，取得了较好的效果。如2004年上海交通大学李秀荣等根据尖刺拟菱形藻的rRNA的特异性序列设计了一组探针，实现了对该种藻的定性定量检测。但是由于白酒等传统发酵中微生物种类繁多，大曲及酒醅取样及处理困难，因此还未见用分子探针直接检测样品中芽孢杆菌属细菌的高效检测方法。因此，需要提供一种芽孢杆菌检测探针组合物，以快速定性定量检测白酒等传统发酵过程中芽孢杆菌属细菌，且检测方法操作简单、重复性好。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，用于传统发酵（白酒、酱油、醋等发酵）行业中，特异性好、灵敏度高、稳定性高、定性定量。本专利技术的技术方案：为了实现上述目的，通过对NCBIGenbank中芽孢杆菌属（Bacillus）所有菌种的16SrRNA进行对比，找到7段属保守序列，将其进行Blastn比对，在915-975区域得到了芽孢杆菌属（Bacillus）的特异性序列。并根据这一特殊序列和夹心杂交方法设计出了一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针：用于特异性结合Bacillus细菌的rRNA的分析探针，用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针，以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针；该检测探针在每毫升培养液芽孢杆菌属（Bacillus）细菌菌体浓度在1.33×102~2.13×105范围内与检测信号强度线性相关，R²=0.99741，而且特异性好、灵敏度高、稳定性高、定性定量，应用到白酒等传统发酵中芽孢杆菌属的实时监测。分析探针具有SEQIDNO:1所示的寡核苷酸序列，长度为61nt，在进行生物信息学比对分析时，该分析探针仅与Bacillus属细菌的16SrRNA915-975区域核苷酸互补，进行特异性结合，而与其他属的rRNA之间存在1个或1个以上核苷酸的连续错配或者缺失，不能很好地配对；与其它属无同源性，结合双特异性核酸检测方法，能够分辨16SrRNA中探针结合部分仅差一个碱基的近缘属。捕获探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，长度为24nt，该捕获探针特异性结合于分析探针一端，在5'端标记有生物素，并通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。信号探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，长度为26nt，该信号探针在5´端具有分析探针互补区，与分析探针的5'端互补结合，该信号探针在3´端有异硫氰酸FITC标记。本专利技术的这组探针可用于以S1酶保护分析和夹心杂交技术检测样品中是否存在芽孢杆菌属（Bacillus）及其数量，所述的检测过程包括下列步骤：（1）将所述分析探针与所述rRNA杂交得到杂交产物：分析探针与rRNA分子杂交后形成DNA/RNA杂合体；（2）在所述DNA/RNA杂合体产物中加入核酸S1酶消化处理得到消化产物：在S1酶的作用下，单链的DNA或RNA以及DNA/RNA杂合体的不匹配部分被消化，留下与目标RNA分子数量上相等的DNA/RNA杂合体；（3）对所述消化产物进行变性处理得到变性产物：将DNA/RNA杂合体变性为DNA单链和RNA单链，变性方法可以采用该领域常用变性技术，例如热变性方法，由于单链RNA非常不稳定，很容易被RNA酶降解掉；（4）将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交，然后洗涤；杂交后形成DNA/DNA杂合体，洗涤是为了除去非特异性吸附；（5）加入所述信号探针与所述分析探针杂交，然后洗涤；杂交后形成夹心杂交复合体，洗涤同样是为了除去非特异性吸附；（6）加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交，然后洗涤；（7）加入所述酶标记的底物以显色。本专利技术的有益效果：该芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针设计巧妙，可以快速定性定量检测芽孢杆菌属（Bacillus）细菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。（1）特异性好：由于传统发酵过程是多种微生物混合发酵的过程，对于特定菌种的检测就较为困难。本专利技术根据芽孢杆菌属（Bacillus）的16SrRNA序列中的特异序列作为靶序列，设计的一组探针，特异性高，对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的DNA相关序列具有高度专一性而对其他属细菌不具有同源性。（2）灵敏度好：本专利技术采用分析探针可以特异性识别靶序列，最后通过一系列反应显色，建立吸光度与菌浓之间的标准曲线，准确度可达90%以上，大大提高了检测精准度。最低检测限可达133个/mL。（3）稳定性高：由于检测过程中设计的分析探针会将菌体内不稳定的RNA信号转化为等量的DNA信号，将保证RNA分子在整个过程不被降解，其他步骤均是针对DNA进行的，从而大大提高了检测的稳定性。（4）定性定量：本探针对芽孢杆菌属（Bacillus）高度专一，并根据标准曲线得到对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的定量检测，打破传统方法的局限性，真正做到了对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的定性定量检测。附图说明图1用本专利技术的检测探针检测白酒发酵中其他属细菌的检测结果比较。图2用本专利技术的检测探针检测芽孢杆菌属（Bacillus）细菌B.subtilis的标准曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明，目的在于更好理解本专利技术的内容而非限制本专利技术的保护范围。在本实施例中，采用特异性探针对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌进行检测，制作其标准曲线，并对其特异性进行验证。1.1芽孢杆菌属16SrRNA特定区域探针的设计与合成将Genbank中已有的芽孢杆菌属所有菌种的16SrRNA保守序列进行比对，找到芽孢杆菌属的保守序列，将其进行Blastn分析，确定915-975区域为芽孢杆菌属特异序列，而与其他属核苷酸无同源性，确定为特征区域，设计分析探针为：5’-AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT-3’（见SEQIDNO:1所示的核苷酸序列）；根据上述探针设计合成检测所需其他探针：捕获探针为5’-ACCAGAAAGCCACGGCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，其特征在于包括三条相互关联的寡核苷酸探针：用于特异性结合芽孢杆菌属的16SrRNA的分析探针，用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针，以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针；分析探针为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，长度为61nt，在进行生物信息学比对分析时，该分析探针仅与Bacillus属的保守区域16SrRNA915-975区域核苷酸互补，而与其它属无...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海麟，王武，辛瑜，夏小乐，张玲，刘婷，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：