一株凝结芽孢杆菌及其使用该菌同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成方法，属于生物化工领域。本发明专利技术使用从土壤中分离得到的一株凝结芽孢杆菌（Bacillus?coagulans）CGMCC?No.7635生物转化木质纤维素生产乳酸。本发明专利技术方法的优点在于此菌株具备高温发酵特性，对木质纤维素水解液中发酵抑制物耐受能力强，并且能高效利用己糖、戊糖和纤维二糖生产乳酸。该发明专利技术工艺，以凝结芽孢杆菌（Bacillus?coagulans）CGMCC?No.7635为菌种，可以将原料预处理、木质纤维素酸解液发酵和纤维素糖化发酵工艺集成，省去了固液分离、料液脱毒步骤。该方法能简化操作工艺、节省设备投资、提高发酵效率，实现木质纤维素高值化应用，具有重要的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一株凝结芽孢杆菌及使用该菌同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成工艺
本专利技术属于生物化工领域，涉及一种以木质纤维素为原料同步糖化共发酵生产乳酸的集成工艺，实现木质纤维素资源的高值化利用，降低乳酸生产成本。
技术介绍
乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工、酿造及纺织等领域。近年来，以乳酸为单体合成的聚乳酸塑料因具有可生物降解特性，被认为是石化塑料的最佳替代品之一。乳酸主要是由发酵法生产，目前文献报道的产乳酸的微生物主要有真菌的根霉菌属(Rhizopus)和细菌的乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)和芽抱杆菌属(Bacillus)。乳杆菌属(Lactobacillus)细菌是广泛应用的工业生产菌株，葡萄糖是发酵生产乳酸的常用碳源，但是由于不同微生物胞内酶系的差异，葡萄糖被转运到细胞内后的代谢途径也有所不同，其代谢过程主要可以分为两类，即同型乳酸发酵途径、异型乳酸发酵途径。同型乳酸发酵是葡萄糖经糖酵解途径(EMP)分解为丙酮酸，理论转化率可达100%。异型乳酸发酵是菌体利用磷酸己糖途径(HMP)，发酵产物除乳酸外还有乙醇、乙酸，乳酸转化率只有60%。近年来，利用可再生生物质资源为原料生产乳酸成为研究热点。木质纤维素是地球上丰富而廉价的可再生资源，用木质纤维素原料代替粮食生产乳酸，不仅能促进可再生资源的转化与利用，而且可有效控制环境污染，意义重大。木质纤维素的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素。木质纤维素生物转化乳酸目前还处于研究阶段，商业化应用存在成本偏高等一系列问题。目前，主要有以下三个方面因素限制了木质纤维素乳酸的工业生产。首先，原料预处理阶段会产生对微生物生长有抑制作用的化合物，如弱酸类物质(甲酸、乙酸等)、呋喃类物质(糠醛、5-羟甲基糠醛等)和酚类化合物(香草醛等)。因此，发酵前需要使用脱毒工艺对原料进行处理。脱毒工艺包括物理方法(旋转蒸发、吸附、萃取等)、化学方法(氢氧化钙沉淀法)和生物方法(酶及微生物降解法)。尽管脱毒工艺得到了深入研究，但是其工业化应用还存在成本偏高的问题。筛选具有抑制物耐受性的微生物，实现木质纤维素预处理后不经脱毒直接发酵，是最理想的解决方法，可以显著降低整体生产成本。其次，纤维素的酶解过程是制约纤维素乳酸工业化应用的另一个技术难点。纤维素酶为能降解纤维素生产葡萄糖的一组酶，纤维素酶至少由三种酶组分:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。葡萄糖和纤维二糖作为酶水解的末端产物，能抑制酶的活力，特别是纤维二糖的抑制作用更强，这样会严重降低酶解效率。将酶解过程与发酵过程集成，即同步糖化与发酵(Simultaneous saccharification and fermentation, SSF)技术受到广泛关注，该技术能将反应过程中形成的酶解产物及时去除，是提高纤维素水解得率的关键措施。但是，目前乳酸生产菌种大多为中温菌，其最适的发酵温度为37~45°C，与商品纤维素酶最佳酶解温度(48~50°C)不一致，如果使用SSF工艺，会导致酶解效率偏低，从而影响整体发酵过程。最后，木质纤维素降解得到的是由己糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖等)和戊糖(木糖、阿拉伯糖等)组成的混合糖。乳酸杆菌(LactobaciIIus)普遍具有很高的葡萄糖发酵能力，但是对于木糖等戊糖的利用能力十分有限。在木质纤维素资源中，木糖含量仅次于葡萄糖，对木糖的利用不容忽视。因此，筛选戊糖高效转化菌株，是实现木质纤维素的高效利用的另一技术关键。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种乳酸发酵新菌种,该菌株普遍具有较高的发酵温度(45~60°C )，且培养基不需灭菌，发酵过程不必无菌操作，极大的降低生产成本。同时，凝结芽孢杆菌能通过磷酸戍糖(Pentose-Phosphate Pathway, PP)途径代谢木糖，3摩尔木糖产生5摩尔乳酸，乳酸理论得率为100%，是理想的木糖发酵菌种。经过对现有技术的检索发现，中国专利 CN200710176060.9、CN200910028930.7、CN201010137769.X、CN02806664.2、CN201010176868.9都报道了凝结芽孢杆菌发酵生产乳酸，但均为利用葡萄糖或者淀粉发酵生产乳酸的工艺。在专利“用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法”(CN201010176868.9)中，描述了利用凝结芽孢杆菌发酵木糖醇副产物中的五碳糖和六碳糖生产乳酸，但没有涉及到木质纤维素利用和SSF发酵工艺。PCT专利PCT/US2005/006774公布了使用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) 36D1发酵经脱毒处理的甘蔗渣稀酸水解液中木糖和葡萄糖发酵，并报到了使用该菌株对商品微晶纤维素的SSF过程，并报道了使用脱毒处理的甘蔗渣稀酸水解液和微晶纤维素进行通过糖化共发酵工艺(Simultaneous saccharif ication and co-fermentation, SSCF),但是脱毒工艺使发酵过程成本提高，工业化应用受到一定限制。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足，优选乳酸发酵菌种，筛选到一株乳酸生产菌，鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),该菌株已于2013年5月23日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC N0.7635。本专利技术的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC N0.7635能在最高58°C条件下发酵生产乳酸，发酵底物包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖及纤维二糖，且乳酸转化率达到95%以上。本专利技术的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC N0.7635对木质纤维素预处理后产生的发酵抑制物具有很好的耐受性，对糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛、乙酸盐的最大耐受浓度分别为 2g/L、2g/L、3g/L、30g/L。基于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC N0.7635的以上特性，专利技术了一种同步糖化共发酵木质纤维素发酵生产乳酸的集成工艺，该工艺将原料预处理、木质纤维素预处理水解液发酵和纤维素同步糖化发酵三个操作单元整合。原料预处理后不需要经过固液分离和脱毒工艺，直接进行木质纤维素预处理水解液发酵和纤维素同步糖化发酵。该工艺的主要步骤包括:( I)木质纤维素的预处理将木质纤维素原料粉碎，采用稀碱液、稀酸液或者蒸汽爆破方法处理，得到木质纤维素预处理料液，其中液体中含有可发酵的还原糖，固形物主要为纤维素。(2)同步糖化共发酵产乳酸以嗜热乳酸生产菌为菌种实现木质纤维素同步糖化共发酵生产乳酸。将步骤(1)得到的木质纤维素原料液调节pH为5.0~7.5之间，接入发酵菌种和氮源启动发酵，发酵过程分为阶段I和阶段II。发酵阶段I培养条件为45~58°C之间，搅拌速度为100~300rpm范围之间，pH值不予控制。待发酵液的pH值降到4.5~5.5后进入发酵阶段II，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株发酵产乳酸的菌株，其分类命名为凝结芽孢杆菌（Bacillus?coagulans），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC?No.7635。
【技术特征摘要】
1.一株发酵产乳酸的菌株，其分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC N0.7635。2.一种同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成工艺，其特征在于:以权利要求1所述的菌株为发酵菌种，以木质纤维素为原料，将原料预处理、木质纤维素酸解液利用和纤维素糖化发酵工艺相集成，其具体的步骤为: (1)木质纤维素的预处理 将木质纤维素原料粉碎，采用稀碱液、稀酸液或者蒸汽爆破方法处理，得到木质纤维素预处理料液，其中液体中含有可发酵的还原糖，固形物主要为纤维素； (2)同步糖化共发酵产乳酸 调节步骤(1)得到的木质纤维素预处理料液的pH，接入权利要求1所述的菌株和氮源，启动发酵，发酵过程分为阶段I和阶段I1:发酵阶段I在一定的温度、搅拌速度下进行；待发酵液的PH值降到一定值后进入发酵阶段II，向发酵体系加入纤维素酶，在一定的温度、搅拌速度、PH值和发酵时间下进行发酵。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的木质纤维素是玉米秸杆、稻草秸杆、小麦秸杆、甘蔗渣、草类以及阔叶树或针叶树的木屑。4.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：万印华，张玉明，陈向荣，齐本坤，沈飞，苏仪，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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