一种纤维素酶固定化载体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纤维素酶固定化载体的制备方法，包括如下步骤：（1）纤维素的炭化；（2）载体的修饰；（3）载体干燥成型。本发明专利技术的优点为：1.本发明专利技术方法采用纤维素为原料制备专门固定纤维素酶的载体，该载体表面积大、吸附位点多，可与酶稳定结合，减少了酶的脱落，提高了酶的吸附率。2.该载体的制备方法简单易行、制备过程绿色环保、无污染。3.该载体可重复使用多次，仍保持较好的酶活，因此，酶及其载体的使用率提高，成本降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种固定化酶载体的制备方法，尤其涉及一种专门固定纤维素酶的纤维素载体的制备方法，属于生物 化工领域。
技术介绍
纤维素酶是一种复合酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌、细菌和动物体都能分泌纤维素酶。通常将纤维素酶分成三类:Cl酶、Cx酶和β葡糖苷酶。其中，Cl酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构；Cx酶是作用于经Cl酶活化的纤维素、分解β -1，4-糖苷键的纤维素酶；β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。纤维素酶可用于将纤维素转化为可发酵糖，进而生产燃料乙醇。由于天然纤维素酶是游离酶，多为一次性直接使用，使用成本高，阻碍了该转化过程的工业化。固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在:首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。因此，将纤维素酶固定化，有利于酶的回收和再利用，有望解决该酶生产应用的实际问题，成为近年来各大院所的研究热点。现有载体上吸附的酶容易脱落，由此导致固定化酶稳定性和活性不高，同时酶固定化载体很少能够重复利用，因此存在载体材料的后处理及废载体的闲置问题。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的是提供一种能大量吸附并稳定固定纤维素酶、同时可以回收再利用的的酶固定化载体的制备方法。技术方案:本专利技术所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，包括如下步骤:(I)纤维素的炭化:将纤维素在400°C -500°C的惰性气体保护条件下炭化；(2)载体的修饰:在炭化后的纤维素中，加入离子液体和处理剂，搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液；(3)载体干燥成型:在纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。其中，步骤(1)中，所述纤维素为微晶纤维素。所述惰性气体为氮气或者氩气。步骤(2)中，所述的离子液体为酸性离子液体。所述酸性离子液体为[DMIM][DMP]、[AMM]CI或[AMM] [OAc]。所述处理剂为聚乙烯醇、聚乙二醇或者溴代丁乙酰亚胺。所述纤维素与加入的离子液体的重量比为1:1~5。加入的处理剂的浓度为0.1-0.2M(mo 1/L)，其中，加入的处理剂与离子液体和纤维素之间不存在比例关系，浓度高也行，浓度低也可以，只要能固定化酶、并为其提供更多接触面积即可。步骤(3)中，所述的溶剂为水或短链醇。加入的水为纤维素载体溶液体积的I~5倍；加入的短链醇为纤维素载体溶液体积的I~3倍。反应机理:高温处理使纤维素材料炭化，从而把纤维素转化成刚性强、稳定性好的碳材料，加入的离子液体可以溶解纤维素为后续反应提供条件，加入的处理剂与炭化纤维结合，并连接在纤维载体的表面和内部，这些处理剂使载体的表面积增大，酶的接触位点增加，同时还可以与酶分子上氨基等基团结合，进而实现酶的固定化。有益效果:本专利技术与现有技术相比，其显著优点为:1、本专利技术方法采用纤维素为原料制备专门固定纤维素酶的载体，该载体表面积大、吸附位点多，可与酶稳定结合，减少了酶的脱落，提高了酶的吸附率。2、该载体的制备方法简单易行、制备过程绿色环保、无污染、成本低廉；3、该载体可重复使用多次，仍保持较好的酶活，因此，酶及其载体的使用率提高，成本降低。【附图说明】图1为本专利技术纤维素酶固定化载体的XRD (X射线衍射)图。【具体实施方式】下面对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1、按如下步骤进行:(I)将微晶纤维素加入管式 炉，氮气保护条件下40(TC炭化lh。(2)取6g炭化的微晶纤维素加入250ml的三口烧瓶，先后加入6gl，3_ 二甲基咪唑磷酸二甲酯[DMM] [DMP]和0.2M的聚乙二醇60ml，搅拌均匀，100°C保温处理20min，使载体的表面和内部发生变化，表面积增大,酶的接触位点增加。(3)在纤维素载体溶液中加入2倍体积的水，搅拌均匀20min，洗涤除去杂质，然后将载体60°C真空干燥，真空脱气制备成载体。如图1是该载体的XRD图谱，纤维素载体已经炭化，30-50度的位置出现小峰说明载体有苯环(即氨基苯甲酸)的存在，氨基苯甲酸的羧基可以与酶蛋白氨基酸的氨基结合。实施例2:(I)取微晶纤维素，氩气保护条件下500°C炭化lh。(2)取Ig炭化的微晶纤维素，先后加入5g氯化烯丙基-3-甲基咪唑[AMM]CI和100ml 0.2M的聚乙烯醇，搅拌均匀，100°C保温处理20min，使载体的表面和内部发生变化，表面积增大，酶的接触位点增加。(3)在纤维素载体溶液中加入I倍体积的乙醇，搅拌均匀20min，洗涤除去杂质，然后将载体65°C真空干燥，真空脱气制备成载体。实施例3:(I)取微晶纤维素，氩气保护条件下450°C炭化lh。(2)取5g炭化的微晶纤维素，先后加入15g[AMM] [OAc]和75ml 0.2M的溴代丁乙酰亚胺，搅拌均匀，80°C保温处理30min，使载体的表面和内部发生变化，表面积增大，酶的接触位点增加。(3)在纤维素载体溶液中加入I倍体积的甲醇，搅拌均匀30min，洗涤除去杂质，然后将载体60°C真空干燥，真空脱气制备成载体。实施例4:取20ml的50mM，pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入50IU的纤维素酶，加入Ig实施例I制备的载体，在30°C水浴摇床中反应24h。过滤获得固定化酶，用醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤直至检测不到蛋白为止。采用考马斯亮蓝法检测纤维素酶的吸附率，测得其吸附率1500mg/g (是原吸附率的96%);同时采用DNS法、以葡萄糖作为标准品检测纤维素酶的活性，测得该固定化酶的表观活性为40IU，重复使用15次后，载体固定化酶活性达到90%左右。实施例5:用实施例2制备的载体重复实施例4，测得纤维素酶的吸附率为1600mg/g (是原吸附率的98%);该固定化酶的表观活性为43IU，重复使用15次后，该载体固定化酶活性达到85%左右。实施例6:用实施例3制备的载体重复实施例4，测得纤维素酶的吸附率为1800mg/g (是原吸附率的99%);该固定化酶的表观活性为45IU，重复使用15次后，该载体固定化酶活性达到80%左右。`本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）纤维素的炭化：将纤维素在400℃?500℃的惰性气体保护条件下炭化；（2）载体的修饰：在炭化后的纤维素中，加入离子液体和处理剂，搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液；（3）载体干燥成型：在纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)纤维素的炭化:将纤维素在400°c-500°C的惰性气体保护条件下炭化； (2)载体的修饰:在炭化后的纤维素中，加入离子液体和处理剂，搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液； (3)载体干燥成型:在纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。2.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述纤维素为微晶纤维素。3.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述惰性气体为氮气或者氩气。4.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述的离子液体为酸性离子液体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，季更生，屠洁，孟春凤，宋文淼，王金正，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：