本发明专利技术公开了一种植物叶绿体多基因转化载体、构建方法及用途，所述植物叶绿体多基因转化载体的外源多顺反子的插入位点位于叶绿体psbC-trnG高频同源重组区。本发明专利技术的优势在于，能够保证多顺反子在转录为mRNA之后断裂为各自独立的稳定的单顺反子mRNA，有效克服了大量多顺反子mRNA不能进行翻译的问题；本发明专利技术能够运用一个强启动子将多个基因一次性转化进目标植物，有效避免了寻找启动子困难、转化后基因沉默的问题；能够保证每个基因都高效地转录和翻译，有效避免了多基因转化基因表达之间存在差异的问题；本发明专利技术在植物基因工程及农作物转基因等方面具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物叶绿体多基因转化载体，同时还涉及该多基因转化载体的构建方法及用途，属于基因工程领域。
技术介绍
高等植物绝大多数重要农艺性状和代谢途径都由多基因控制，为了增进这些重要农艺性状的表现，研究人员多通过向目标农作物转化基因来实现。这些基因要么是作物本身已有的基因，通过转化使其在作物中过量表达；要么是农作物本身没有的基因，这些基因源于其它生物或者由人工合成而来。但是因为绝大多数重要的性状都由多基因编码，转化单一基因很难达到预期的效果。向目标农作物转化多个基因或者控制整个代谢途径的多个关键基因就变得特别重要。 目前已知的植物多基因转化技术有下面几个:1)首先通过转化单一基因得到转单基因的植株，然后通过有性杂交得到转化多个基因的转基因植株，该方法所需时间长，工作量大，不能够体现出植物基因工程的优势；2)再转化策略，首先向目标农作物转化单一基因，得到转基因植株后再继续转化第二个基因，以此类推，得到多基因转化个体，该方法的缺点与第一种类似，育种周期长，后代筛选工作量大，多次转化需要应用多个抗生素筛选标记，而且多次转化容易诱发基因沉默，很难达到预期目的；3)共转化策略，将多个不同的表达载体同时转化农杆菌，然后进行侵染，从转化后代中进行筛选，该方法偶然性大，成功几率非常低；4)转录单位策略，将多个基因串联起来，每个基因都含有自己的启动子、终止子，构建各自的基因表达盒，然后进行转化，该方法的缺陷在于所转化的每个基因都必须连接有自己的启动子，如果每个基因都使用不同的启动子，少数几个基因的转化还可以，如果涉及到多个基因，寻找各自独立、效果良好的启动子将变得非常困难；如果使用相同的启动子，则会造成基因沉默，所转化基因不能表达；5)融合蛋白策略，将前边基因的终止密码子去掉，用一段病毒基因序列与下一个基因相连接，融合基因翻译以后，中间病毒基因编码的氨基酸序列被水解掉，从而使各个基因得以表达，该方法的优势在于能够一次转化即可成功，缺点在于，各个基因的表达效率不一致，顺序排列如边的基因表达的几率闻，排在后边的基因表达效率低。相对于上述几种多基因转化的缺点，近几年发展起来的叶绿体转化具有明显的优势。其优势主要有以下几点:1)外源基因表达水平高；2)外源基因定点整合，没有基因沉默现象；3)叶绿体随母体遗传，外源基因不会随花粉外溢；4)叶绿体是原核表达方式，只需要一个启动子和一个终止子。理论上，外源基因通过叶绿体转化，能够实现多基因转化的目的。但是，研究发现，将多个外源基因按照细菌操纵子的形式连接起来以后进行转化，虽然在转基因植株中确实得到了预期的多顺反子转录片段，但是占相当比例的多顺反子mRNA不能够被翻译成氨基酸序列，而且在得到多顺反子mRNA的同时，也得到了许多比预期小的mRNA片段，表明部分多顺反子的转录体发生了剪切或降解。对转基因植株的表型性状进行检测后发现，目的性状的表现也比预期低很多。据此推测，细菌中操纵子的表达与叶绿体中操纵子的表达可能存在着相当程度的差异；尽管叶绿体基因的表达方式保留着其祖先蓝细菌的特点一叶绿体绝大多数操纵子转录起始位点(通过叶绿体基因组自身编码的RNA聚合酶识别)上游具有一个可以识别的-35盒与一个-1OTATA盒)和翻译起始信号(包括核糖体结合位点等)，通过叶绿体转化新的生物合成途径的操纵子似乎是理所当然能够进行的，但是细菌中操纵子的表达模式与叶绿体中操纵子的表达模式之间的差异依然相当大。细菌中多顺反子转录体直接进行翻译，而在叶绿体中经常不是这样。叶绿体中绝大多数多顺反子转录体需要进行转录后处理，剪切为单顺反子或寡顺反子单元。多顺反子转录体前体剪切为单顺反子mRNA对于下游顺反子的翻译可能是必需的。例如，在烟草体外转录系统中，双顺反子psaC-ndhD转录子前体中的ndhD不能进行翻译。原因可能是形成了 RNA 二级结构，在这个二级结构中，psaC编码区中一个8nt序列与下游的ndhD的5’UTR形成互补结构，遮盖了翻译起始区域(Hirose and Suguira, Both RNA editingand RNA cleavage are re quired for translation of tobacco chloroplast ndhDmRNA:a possible regulatory mechanism for the expression of a chloroplast operonconsisting of functionally unrelated genes.EMBO J，1997，16:6804-6811)。许多细胞核突变体呈现叶绿体转录体前体顺反子间处理功能缺陷，也表明顺反子间RNA处理对于操纵子中所有顺反子的有效翻译是非常重要的。例如，玉米CTPl突变体不能够在顺反子petB和petD之间进行剪切，造成petD翻译的缺失(Barkan et al.A nuclear mutation inmaize blocks the processing and translation of several chloroplast mRNAs andprovides evidence for the differential translation of alternative mRNA forms.EMBO J，1994，13:3170-3181)。拟南芥突变体hcf 107由于顺反子psbH不能够从一个含有5个基因的操纵子psbB的转录体上剪切下来,造成了顺反子psbH翻译的缺失(Felderet al.The nucleus-encoded HCF107gene of Arabidopsis provides a link betweenintercistronic RNA processing and the accumulation of translation-competentpsbHtranscripts in chloroplasts.Plant Cell，2001，13:2127-2141)。另一个拟南芥突变体cit2，由于在顺反子i*pS7和ndhB之间的剪切功能受到损害，造成了 NDH复合体的缺失，很可能是由于ndhB不能够被未处理的双顺反子转录体翻译造成的(Hashimoto et al.Anucleus-encoded factor，CRR2，is essential for the expression of chloroplast ndhBin Arabidopsis.Plant J，2003，36:541-549)。在对一个人工合成的多顺反子RNA翻译起始进行研究的过程中，发现在叶绿体转化植物的Shine-Dalgarno序列应用中,存在一个明显的从5’到3’的极性，而用相同的转化载体在大肠杆菌中进行分析时却没有发现该现象(Drechsel and Bock.Selection of Shine-Dalgarno sequences in plastids.NucleicAcids Res.,2010，39:1427-1438)。暗示翻译起始速度沿5’到3’的方向逐步降低。这些实验结果和现象都表明细菌操纵子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述植物叶绿体多基因转化载体的外源多顺反子的插入位点位于叶绿体psbC?trnG高频同源重组区。
【技术特征摘要】
1.一种植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述植物叶绿体多基因转化载体的外源多顺反子的插入位点位于叶绿体psbC-trnG高频同源重组区。2.根据权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述植物叶绿体多基因转化载体包括如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述外源多顺反子只有一个启动子，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。4.根据权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述外源多顺反子中每两个相邻基因之间都由一段如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列连接。5.根据权利要求4所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述外源多顺反子中的每个基因起始密码子的前面都连有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。6....
【专利技术属性】
技术研发人员：舒海燕，常胜合，
申请(专利权)人：舒海燕，常胜合，
类型：发明
国别省市：
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