构建和培育耐盐草坪草的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）、构建农杆菌重组二元质粒：将拟南芥SOS1，SOS2，SOS3，CBL10完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；（二）、转化农杆菌和草坪草：将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；（三）、选择和培育转基因草坪草。本发明专利技术的有益之处在于：转基因耐盐草坪草的构建和培育为改良盐碱地提供了一个新途径，它使盐碱地的改良工程提升到了高新科技的基因工程；这种方法的投入量很少，并且无性繁殖使它具有了不可估量的长远效益。

Method for constructing and cultivating salt resistant lawn grass

The invention discloses a method for the construction and cultivation of salt tolerant turfgrass, characterized by comprising the following steps: (a) two yuan, the construction of recombinant plasmid of Agrobacterium: SOS2, Arabidopsis SOS1, SOS3, gene clone CBL10 complete, and implanted in Escherichia coli two recombinant plasmid, two yuan plasmid; (two), Agrobacterium tumefaciens and turfgrass: recombinant plasmid into Agrobacterium was two yuan, and the infection of callus of turfgrass; (three), the selection and cultivation of transgenic turfgrass. The invention has the advantages that the construction and cultivation of transgenic salt tolerant turfgrass for improving saline alkali soil provides a new way, it makes improvement project of saline to genetic engineering technology; input this method rarely, and asexual reproduction makes it have long-term benefits immeasurable.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于生物转基因
。
技术介绍
目前，我国耕地有18亿亩，盐碱地面积占到5.4亿亩，我国西部地区地处干旱半干旱地区，由于干旱缺水，盐碱化、荒漠化现象严重。同时，由于近几年来气候原因，全球变暖和人类的活动，使得全国耕地面积变化总体呈现一种下降的趋势，这种现象也日趋严重，已经成为亟待解决的世界性问题。现有改善盐碱地的主要方法是构建大量的排水网络，使地表盐分随着灌溉水或降雨流入低处，以及将脱硫渣掺入盐碱地，改善土壤PH值，促进植物生长。但是所有这些方法需要大量的前期投入。草坪草作为重要的禾本科草本植物，具有很多优点，是现代化都市中不可缺少的生态环境组成部分。不仅具有保持水土、改造自然、美化环境、改善生态环境等功能，而且可以提供高质量的运动和休憩场地。长期种植还可以改良盐碱土壤，防止水土流失，增加土壤的肥沃度、保护生态环境。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用基因工程的方法构建并培育能耐较高盐分的草坪草的方法，从而改善和利用盐碱地。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案:一种，其特征在于，包括以下步骤:(一)、构建农杆菌重组二元质粒:将拟南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBLlO完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；(二)、转化农杆菌和草坪草:将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；(三)、选择和培育转基因草坪草。[0011 ] 前述的，其特征在于，在步骤(一冲，选择KEGT-A作为重组二元质粒基本框架，在KEGT-A插入选择基因BAR基因。前述的，其特征在于，重组二元质粒的结构为:RB 基因-TM220 基因-SOSl 基因-S0S3 基因-S0S2 基因-TMl 基因-CBLlO 基因-TM2基因-BAR基因-TM220基因-LB基因。前述的，其特征在于，在步骤(二)中，前述的草坪草愈伤组织由草坪草 种子在MS+5.5ml/L2, 4_D培养基中转化而来。前述的，其特征在于，在步骤(三)中，前述的转基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培养基中分化出幼芽。前述的，其特征在于，在步骤(三)中，前述的转基因草坪草在1/2MS+0.3ml/L IBA培养基中分化出根，前述MS培养基的铁盐加倍。本专利技术的有益之处在于:转基因耐盐草坪草的构建和培育为改良盐碱地提供了一个新途径，它使盐碱地的改良工程提升到了高新科技的基因工程；这种方法的投入量很少，并且无性繁殖使它具有了不可估量的长远效益。【附图说明】图1是本专利技术的的流程图；图2是二元重组质粒的结构示意图；图3是转基因苜蓿基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；图4是SOSl基因PCR扩增电泳图；图5是S0S2基因PCR扩 增电泳图；图6是S0S3基因PCR扩增电泳图；图7是CBLlO基因PCR扩增电泳图；图8是Southern杂交结果图；图9是Northern杂交中SOSl基因的转录水平表达结果图；图10是Northern杂交中S0S2基因的转录水平表达结果图；图11是Northern杂交中S0S3基因的转录水平表达结果图；图12是Northern杂交中CBL10基因的转录水平表达结果图。【具体实施方式】以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。参照图1，本专利技术的，包括以下步骤:(一)、构建农杆菌重组二元质粒:将拟南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBL10完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；(二)、转化农杆菌和草坪草:将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；(三)、选择和培育转基因草坪草。下面以高羊茅为例进行说明，其他草坪草的操作一样。首先，用PCR将拟南芥SOS基因的完整编码序列从它的cDNA克隆中扩增。根据bar、S0S1、S0S2、S0S3、CBL10基因序列，PCR合成引物如下:BarF:GCG GTC TGC ACC ATC GTC ABarR:GTA CCG GCA GGC TGA AGT CCAS0S1-R:5，CCT GCC AAA GGA AAT CAT C3，S0S1-F:5’GCT TGC TAC ATT TCT GCT G3’S0S2-R:5' CCA TTG AGT TCG CTA CAG C3’S0S2-F:5’ TTA GTG GAC AGG GTT ACG A3’S0S3-F:5'GGG ATG GGC TGC TCT GTA TCG AAG3’S0S3-R:5'ACC ACC GAG CTC TAG GAA GAT ACG3’CBL10-F:5，GCA ATT CTG CGC CGT CTT TAT ACC3，CBLlO-R:5’CAT TTG TTG CAC CTC TTC TCG CTC3’PCR反应条件如下:在25μ I的PCR反应管中，加入下述反应试剂:0.5μ I Taq酶，2.0 μ I引物，2.0 μ IdNTP，2.5μ 110 X buffer, 1.0μ I 模板和 17.0 μ lddH20。(I) bar基因PCR反应程序如下:94°C 预变性 5min ；94。(:变性 30sec ；58°C退火 3Osec;72°C 延伸 Imin ； 72? 延伸 5min ；循环数:30；4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。(2) SOSl基因PCR反应程序如下:94°C 预变性 5min ；94。(:变性 30sec ；53°C退火 50sec ;72? 延伸 Imin ；72°C 延伸 5min ；循环数:30；4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。(3) S0S2基因PCR反应程序如下:94°C 预变性 5min ；94。(:变性 30sec ；52°C退火 30sec72。(:延伸 Imin ；72。〇延伸511^11;循环数:30；4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。(4) S0S3基因PCR反应程序如下:94°C 预变性 5min ；94。(:变性 30sec ；59O退火 3Osec;72。(:延伸 Imin ；72 O 延伸 5 min ；循环数:30；4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。(5) CBLlO基因PCR反应程序如下:94。0预变性511^11;94?变性 30sec ；57。〇退火3086。；72 O 延伸 Imin ；72 O 延伸 5min ；循环数:30；4°C保存。PCR扩增后 将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。然后，选择KEGT-A作为重组二元质粒基本框架，在KEGT-A插入选择基因bar基因。重组二元质粒的结构如图2所示。接下来，含有SOS基因的重组二元质粒先被用来转化农杆菌；重组农杆菌再被用来转化草坪草愈伤组织。该愈伤组织在含有植物激素的培养基中长成整株转基因草坪草。具体过程如下:1、草坪草种子在MS+5.5ml/L2, 4_D培养基中转化为愈本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）、构建农杆菌重组二元质粒：将拟南芥SOS1，SOS2，SOS3，CBL10完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；（二）、转化农杆菌和草坪草：将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；（三）、选择和培育转基因草坪草。

【技术特征摘要】
1.构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，包括以下步骤: (一)、构建农杆菌重组二元质粒:将拟南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBLlO完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒； (二)、转化农杆菌和草坪草:将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织； (三)、选择和培育转基因草坪草。2.根据权利要求1所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(一)中，选择KEGT-A作为重组二元质粒基本框架，在KEGT-A插入选择基因BAR基因。3.根据权利要求2所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，重组二元质粒的结构为: RB基因-TM220基因-SOSl基因-S...

【专利技术属性】
技术研发人员：麻冬梅，许兴，郭伶娜，蔡进军，杨亚亚，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：