转化大豆的方法技术

本发明专利技术涉及一种转化大豆的方法，包括：大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块。本发明专利技术转化大豆的方法首次公开了将预处理后的大豆分生组织块作为外植体材料；在农杆菌侵染之前通过对外植体材料进行高浓度的细胞分裂素处理，使得大豆的分生组织处于活跃状态，易于外源基因的插入，同时通过分生组织的增值变大，使得侵染过程更加便于操作；在农杆菌侵染过程中，加入了超声波处理，使外源基因插入植物基因组的效率大大增加，大豆的转化效率可达10%；同时转化周期短、嵌合体少、转化成本低。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种，包括：大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块。本专利技术首次公开了将预处理后的大豆分生组织块作为外植体材料；在农杆菌侵染之前通过对外植体材料进行高浓度的细胞分裂素处理，使得大豆的分生组织处于活跃状态，易于外源基因的插入，同时通过分生组织的增值变大，使得侵染过程更加便于操作；在农杆菌侵染过程中，加入了超声波处理，使外源基因插入植物基因组的效率大大增加，大豆的转化效率可达10%；同时转化周期短、嵌合体少、转化成本低。【专利说明】
本专利技术涉及一种植物转化的方法，特别是涉及一种转化大豆组织的方法。
技术介绍
大豆(Glycine max)起源于中国，是植物蛋白质的主要来源，也是中国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，种植面积仅次于水稻、玉米和小麦，居第四位。为了提高大豆耐除草剂、抗病虫害及生理逆境的能力、改善大豆品质、增加大豆产量，除了采用传统的育种方法外，可通过基因工程手段实现有目的的遗传工程改良。大豆的遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法、电击法、PEG法、显微注射法、超声波辅助法和花粉管导入法等，其中农杆菌介导法为大豆常用的转基因方法。而农杆菌介导法不仅受到植物基因型依赖和菌株特异性的限制，不同的大豆受体系统也是大豆遗传转化的重要环节，目前常用的大豆受体系统主要有:(I)子叶节受体系统:大豆转化过程中运用最早最普遍的就是子叶节受体系统(Hinchee et al.，1988)。该系统是将发芽5天左右的大豆在下胚轴离子叶3_5mm处横切，然后将两片子叶纵切开，去掉上胚轴部分。这种受体系统的特点是:没有经过愈伤组织阶段直接分化成不定芽；得到再生苗时间短，一般3个月就可得到生根的植株；再生频率高等。由于这些特点，它受到很多大豆分子育种工作者的青睐，但运用这种方法在切子叶节时需要进行精心人工操作，且不定芽常起源于多细胞，所形成的再生植株有较多的嵌合体，加大了后代的筛选难度，子叶节受体系统的转化效率较低。(2)大豆胚尖受体系统:大豆胚尖受体系统是将发芽I天的大豆剥去种皮，将两片子叶从胚轴上剥掉，去掉真叶，再用农杆菌侵染胚尖。大豆胚尖再生系统既可以用幼胚胚尖，也可以用成熟胚的胚尖。它的特点是得到再生苗时间短，1-2个月就可以得到再生植株，且再生植株嵌合体少。基于上述特点，越来越多的研究者采用这种方法。但这种方法在农杆菌侵染阶段的技术难度较高，筛选时较困难，且得到的转化子较少。(3)体细胞胚受体系统:这种方法是经体细胞发生形成的在形态和功能上类似于有性胚的结构，然后以其为转化受体。现在主要以未成熟胚的子叶为外植体，经过诱导后形成体细胞胚。这种受体系统的特点是:体细胞胚的形成与大豆基因型有很大关系，一旦形成体细胞胚后可以大量扩繁，受体数量多，易于转化，但起源于多细胞，增加了筛选的难度。(4)半子叶受体系统:用子叶作为受体系统是Paz等于2005年首先提出来的，这种方法是将用水浸泡过夜的大豆种子，剥去种皮后，将胚轴部分去掉，留下子叶，然后将子叶与农杆菌共培养。这种方法避免了由于子叶节划伤时需要精心操作的人为因素影响，使操作更简单；但这种转化方法出苗困难，转化效率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，有效克服现有技术技术难度高、筛选难度大、嵌合体较多、转化效率偏低等技术缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供了一种，包括:大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块。优选地，所述细胞分裂素为lmg/L6_苄基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一种或任意组合。进一步地，所述预处理培养基还包括乙酰丁香酮。更进一步地，所述还包括所述预处理后的分生组织块创伤后进行超声波处理2-4分钟。在上述技术方案的基础上，所述还包括超声波处理后的分生组织块在含有选择剂的培养基上培养，所述选择剂是草丁膦。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种生产稳定转化的大豆植物的方法，包括: 大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块；侵染后的分生组织块与所述农杆菌共培养；在含有选择剂的培养基上培养并选择转化的抗性组织；转化的抗性组织再生为大豆植物。优选地，所述细胞分裂素为lmg/L6_苄基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一种或任意组合。进一步地，所述预处理培养基还包括乙酰丁香酮。更进一步地，所述选择剂是草丁膦。在上述技术方案的基础上，所述生产稳定转化的大豆植物的方法还包括所述预处理后的分生组织块创伤后进行超声波处理2-4分钟。本专利技术中的克隆基因、表达盒、载体(例如质粒)、蛋白和蛋白片段、以及转化的细胞核植物均可使用标准方法生产。本专利技术可用于在大豆植物中表达任何目的基因。目的基因可以是耐除草剂基因、抗病基因或抗虫基因，或者是选择或评价标记，并含有植物可操作的启动子、编码区和终止子区。耐除草剂基因包括对咪唑啉酮或磺酰脲除草剂耐受的AHAS基因、对草丁膦除草剂耐受的pat或bar基因、对草甘膦除草剂耐受的EPSPS基因等。抗病基因包括抗生素合成酶基因，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物来源的抗性基因等。抗虫基因包括苏云金芽孢杆菌杀虫基因。目的基因也可以编码与生物化学途径有关的酶，该酶的表达可改变食物、饲料、营养药和/或药物生产中重要的性状。目的基因可以位于质粒上。适合本专利技术使用的质粒可以含有一个以上目的基因和/或农杆菌可含有带有不同目的基因的不同质粒。本专利技术中所述“大豆”是指Glycine max，所述方法是以农杆菌介导的目的基因传输到大豆细胞，之后再生为转化的大豆植物为基础的。本专利技术的方法独立于栽培品种。在选择剂存在的情况下培养转化的大豆细胞。优选地，用草丁膦乙酰转移酶(PAT)基因转化，并且转化的基因在草丁膦存在的情况下培养。在含有草丁膦为选择剂的培养基中，PAT基因转化的大豆细胞选择性生长。含有异源核酸(即含有按照本专利技术的方法转化的细胞或组织)的转基因植物以及通过该转基因植物产生的种子和后代是本专利技术所涉及的。将转化的细胞培养成有用栽培品种的方法是本领域技术人员公知的。植物组织体外培养技术和整个植株再生技术也是公知的。相应的，所述“种子”包括这些转化植物的种子以及转化植物后代产生的种子。所述“植物”不仅包括转化和再生的植物，还包括通过本专利技术的方法产生的转化和再生植物的后代。可以从本专利技术的方法产生的植物中筛选成功的转化植物。为了开发改良的植物和种子品系，可以持续地筛选和选择本专利技术再生植物的种子和子代植物以使转基因和整合的核酸序列持续存在。因此，可以将所需要的转基因核酸序列移入(即渐渗或交配)其它的遗传品系如某些原种或商业上有用的品系或品种中。渐渗目的基因进入遗传植物品系的方法可通过本领域公知的多种技术来实现，包括通过传统的育种、原生质体融合、细胞核转移以及染色体转移。育种方法和技术也是本领域公知的。根据本专利技术获得的转基因植物和自交系可用于生产商业上有价值的杂交植物和农作物。本专利技术提供了一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化大豆的方法，其特征在于，包括：大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾志伟，刘雁华，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心，
类型：发明
国别省市：