一种获得紫色叶背草莓的方法，其是携带已构建完成的植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros的根癌农杆菌，在含卡那霉素的LB液体培养基中培养12-16小时后备用；将草莓哈尼组培苗在继代培养基上培养30-40天，取伸展叶片剪成叶盘，放在备用培养物中3-7分钟，后接种在再生培养基上暗培养1-2天；将叶盘转接在含头孢霉素300-400mg/L、卡那霉素5mg/L的分化培养基上，在（25±1）℃、光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30-40天，将获得的不定芽切下，接种在生根培养基上，置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30-40天完成生根；进一步鉴定后获得紫色叶背的草莓植株。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种获得紫色叶背草莓的方法，其是携带已构建完成的植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros的根癌农杆菌，在含卡那霉素的LB液体培养基中培养12-16小时后备用；将草莓哈尼组培苗在继代培养基上培养30-40天，取伸展叶片剪成叶盘，放在备用培养物中3-7分钟，后接种在再生培养基上暗培养1-2天；将叶盘转接在含头孢霉素300-400mg/L、卡那霉素5mg/L的分化培养基上，在（25±1）℃、光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30-40天，将获得的不定芽切下，接种在生根培养基上，置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30-40天完成生根；进一步鉴定后获得紫色叶背的草莓植株。【专利说明】
本专利技术涉及一种产生紫色叶背草莓的方法，特别地，是一种通过基因调控手段产生紫色叶背草莓植株的方法。
技术介绍
草莓(Fragaria ananassa Duch)是蔷薇科草莓属多年生草本植物,是一种世界各国广泛栽培的水果，素有水果皇后之称。由于其高杂合性和多倍性，使得杂交育种工作周期长、工作量大。利用基因调控技术培育草莓品种可以定向改良现有品种，大大提高育种效率。将成为草莓品种改良的一种重要手段，目前应用于草莓上的基因导入法主要是农杆菌介导的叶盘法。花青素可以对人体的许多疾病如癌症、心血管疾病和神经性疾病等起防御作用，草莓本身具有完整的花青素合成路径。利用该项技术和方法就可以获得含更多花青素的果实。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种植物表达载体pCAMBIA2301-del_ros及其构建方法。本专利技术的另一个目的是提供一种产生紫色叶背草莓的方法，特别地，是一种通过基因调控手段产生紫色叶背草莓植株的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案:一种植物表达载体pCAMBIA2301-del_ros,其序列如序列表SEQ ID:N0.1所示。如上所述的植物表达载体pCAMBIA2301-del_ros，其图谱如图1所示。`一种如上所述植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros的构建方法，包括以下步骤:第一步，pBI121-del-Tnos表达载体构建在花青素调控基因del两端引入BamHI和SacI酶切位点，将质粒pBI121-35s-Tn0s用BamHI和SacI两个内切酶酶切后回收载体大片段，将del基因的片段，插入pBI121-35s-Tnos的BamHI和SacI位点间，35s启动的del基因表达载体pBI121-35s-del_Tnos 构建完成；第二步，pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos表达载体的构建在花青素调控基因ros两端引入NcoI和BstEII酶切位点，将质粒pCAMBIA301-35S-Tnos用NcoI和BstEII两个内切酶酶切后回收载体大片段pCAMBIA1301-35s-Tnos,将ros基因的片段插入得到用35s驱动的ros基因表达载体pCAMBIA1301-35s-ros - Tnos ；第三步，pCAMBIA2301-del-ros表达载体的构建将质粒pCAMBIA2301-35S-Tnos用HindIII和BstEII两个内切酶酶切后回收载体大片段 PCAMBIA2301-Tnos，将表达载体 pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos 用 HindIII和BstEII两个内切酶酶切后回收载体片段-35s-r0s-，将载体片段-35S_rOS-插入PCAMBIA2301-Tnos 的 HindIII 和 BstEII 位点之间，得到 pCAMBIA2301-35s-ros_Tnos表达载体，将该表达载体用BamHI和Kpnl两个内切酶酶切后回收载体大片段 pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos，将表达载体 pBI121-35s-del-Tnos 的两端以 PCR 的方法添加 酶切位点Kpnl和Bglll，酶切后将所得的片段插入由Kpnl和BamHI两个内切酶酶切后回 收的载体大片段pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos上，得到以Kan基因为筛选标记35S分别启动 的del、ros基因表达载体pCAMBIA2301-35s-del-Tnos-35s-ros_Tnos,即得植物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros。一种获得紫色叶背草莓的方法，该方法的步骤如下：A.构建植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros，将其转化根癌农杆菌LBA4404，随后 在28°C下在含lOOmg ? L—1卡那霉素的LB液体培养基中培养12-16小时；B.将草莓哈尼的组织培养苗在继代培养基上培养30-40天，之后在无菌条件下取 组织培养伸展叶片，剪成面积约0. lcm2的叶盘，放在步骤A得到的培养物中3-7分钟，然后 接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1-2天；C.将经过步骤B培养的草莓叶盘转接在含300-400mg七1头孢霉素和5mg吨―1卡 那霉素的分化培养基上，在温度（25±1) °C、光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度 为30 y mol ? m_2 ? s—1的条件下再培养30-40天，获得转化芽；D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光 照/8小时黑暗、光照强度为30 u mol ? m_2 ? s—1的条件下培养30-40天，即可完成生根；E.取步骤D中得到的植株进行草莓叶片的外观鉴定，从而获得紫色叶背的草莓。如上所述的方法，优选地，所述步骤B中，草莓哈尼的组织培养苗按照以下步骤得 到：秋季采草莓哈尼匍匐茎上饱满的芽，流水冲洗3小时，用0. 1%的HgC12水溶液处理6分 钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将芽接种到初代培养基上；在接种后的 第二天开始有部分材料开始褐化，一旦发现有褐化的材料，马上更换为新的初代培养基，直 到褐化消除；接种10天时，饱满的芽都开始萌发，30天时长成约3cm左右的组培苗。如上所述的方法，优选地，所述初代培养基为在MS基本培养基中附加30g ? I71蔗 糖、6. 5g ? I71 琼脂粉、1. Omg ? L_16-节基腺嘌呤（6-benzyladenine)和 0. 2mg ? I71 卩引哚丁酸 (indole-3-butyric acid), pH5. 6 的培养基。如上所述的方法，优选地，所述步骤B中，继代培养基为在MS基本培养基中附加 30g ? L—1蔗糖、6. 5g ? L—1琼脂粉、0. 2-0. 3mg ? L^6-苄基腺嘌呤和0. lmg ? L—1吲哚丁酸， pH5. 6的培养基。如上所述的方法，优选地，所述步骤B中，再生培养基为在MS基本培养基中附加 30g ? L-1 蔗糖、6. 5g ? L-1 琼脂粉、2. 0-4. Omg ? L^N-苯基-N’ -1，2，3-噻二唑-5-脲，pH5. 6的培养基。如上所述的方法，优选地，所述步骤C中，分化培养基为在MS基本培养基中 附加30g ? I/1鹿糖、6. 5g ? I71琼脂粉、300-400mg ? I71头孢霉素、5mg ? I71卡那霉素、 2. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物表达载体pCAMBIA2301?del?ros，其特征在于，其序列如序列表SEQ?ID：No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金万梅，王华，范艳珍，王文娟，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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