一种制备绵羊MSTN基因单克隆抗体疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备绵羊MSTN基因单克隆抗体疫苗的方法：运用生物信息学方法分析并筛选绵羊MSTN基因单克隆抗体所需抗原肽的抗原表位，把这些抗原表位核苷酸序列串联组合，克隆并原核表达这些表位组合模式，将获得的相关抗原肽分别免疫小鼠，用杂交瘤细胞融合技术分别制备针对绵羊MSTN基因特异不同组合模式抗原表位的单克隆抗体，筛选并检测这些细胞株，从而获得具有较高效价的针对绵羊MSTN基因不同抗原表位的单克隆抗体疫苗。本发明专利技术采用单克隆抗体技术制备抗绵羊MSTN基因编码蛋白的单克隆抗体，这种抗体只能特异地与抗原分子上的一个抗原决定簇结合反应，在培养过程中只要不发生变异，不同时间内分泌的抗体都能保持同样的结构和功能。本发明专利技术简便易行，易于推广，免疫绵羊后可以使绵羊MSTN基因失活，从而使绵羊产生双肌表型，大大提高单位绵羊的产肉率。

【技术实现步骤摘要】
一种制备绵羊MSTN基因单克隆抗体疫苗的方法
本专利技术涉及基因克隆与原核表达技术、杂交瘤与单克隆抗体制备技术。具体地说是运用基因克隆方法制备绵羊MSTN(MSTN:Myostatin，肌生成抑制素)基因单克隆抗体所需抗原肽，再利用小鼠杂交瘤细胞融合技术制备针对绵羊MSTN基因的单克隆抗体疫苗的方法。
技术介绍
绵羊MSTN基因是动物骨骼肌生长的负调控因子，如果MSTN基因失活，能使动物肌肉生长较为发达，瘦肉率大大提高。如MSTN基因突变、缺失或失活小鼠比野生型小鼠体格大2-3倍。MSTN基因失活的动物生长为双肌动物，如双肌牛、双肌狗等等，该基因的研究近年来受到人们的高度重视。研究人员采用了很多使该基因失活的方法，如基因敲除、基因沉默等技术，但是这些方法在生产实践中都难以具体实施。本专利技术利用单克隆抗体疫苗的方法使该基因失活，简便易行，在生产实践中可以大力推广，因此具有非常重要的实践意义。现代分子生物学技术可以有效地实现基因克隆，但基因表达和蛋白纯化仍存在困难。例如在大肠杆菌表达系统，不能表达某些基因或表达产物常常形成没有生物学活性的包涵体，对于一些结构复杂的蛋白质或分子量大于lOOkDa的大蛋白，采用现有大肠杆菌表达系统就相对困难，同时又因为每种蛋白质分子所带电荷、分子量及疏水性等方面存在差异，所以会存在表达产物纯化较难、纯化周期较长和产量较低等缺点。 绵羊肌生成抑制素，其基因全长约1128bp，编码约375aa，考虑到这些方面的原因，曾经一段时间把研究工作放在基因克隆并表达肌肉抑制素基因的C-末端上，C-末端的保守功能域，基因长约330bp，编码llOaa，目前大部分实验室也都克隆并表达出其C-末端，但C-末端并不能包含肌肉抑制素的全部抗原表位，而且C-末端抗原表位不一定是其优势抗原表位。所以如果表达出C-末端蛋白，并用其为免疫原制备单克隆抗体，制备的单克隆抗体还要面临筛选抗原表位的工作，筛选出的抗原表位不能代表肌肉抑制素的单克隆抗体疫苗，只能是其C-末端单克隆抗体疫苗。现有技术制备单克隆抗体的实验室方法中:有化学合成抗原肽或生物合成抗原肽两种方法:采用化学合成抗原肽制备单克隆抗体的方法，存在化学合成抗原生物学活性条件差的缺点，缺乏足够的免疫原性，很难像蛋白抗原那样诱导集体的多种免疫反应；此外，还表现在缺乏足够多的B细胞抗原表位的刺激，一般来说单独的抗原决定簇的免疫原性较弱，通常要与载体偶联，或以融合蛋白的形式进行免疫，以提高免疫原性。采用生物合成抗原肽制备单克隆抗体的方法，如:先运用生物信息学预测得出绵羊MSTN编码抗原多表位的最佳组合模式，以期得到具有生物活性的免疫原，再运用生物合成法合成这些抗原表位的核苷酸序列，并构建这些基因表位的原核表达载体，并表达这些表位基因的抗原肽序列。因为所表达的抗原肽大大缩短，所以比较容易表达。并且将制备出的免疫用抗原肽，免疫BALB/c小鼠制备单抗，可以提高免疫原性，减少获得单克隆抗体后，做抗体特异性检测筛选等方面的工作量。前期研究获得单克隆抗体的方法中有连接BSA或KLH载体蛋白的，但之后的特异性检测试验要考虑得到的单克隆抗体，是合成的抗原肽的抗体还是蛋白载体的抗体，故不采用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供3种生物合成绵羊MSTNM基因多表位组合模式序列，用基因克隆与原核表达技术制备这些免疫用抗原肽，并将这些抗原肽免疫小鼠用杂交瘤细胞融合技术制备针对绵羊MSTN基因的几种单克隆抗体疫苗的新方法。本专利技术是这样实现的:运用生物信息学方法分析并筛选绵羊MSTN基因单克隆抗体所需抗原肽的抗原表位，把这些抗原表位核苷酸序列串联组合，克隆并原核表达这些表位组合模式，将获得的相关抗原肽分别免疫小鼠，用杂交瘤细胞融合技术分别制备针对绵羊MSTN基因特异不同组合模式抗原表位的单克隆抗体，筛选并检测这些细胞株，从而获得具有较高效价的针对绵羊MSTN基因不同抗原表位的单克隆抗体疫苗。本专利技术依下述方法步骤进行: 1、利用生物信息学方法分析并筛选绵羊MSTN基因的抗原表位。2、将这些抗原表位串联成3种组合模式，人工合成这些绵羊MSTN基因抗原表位组合模式。3、利用基因克隆与原核表达技术分别进行这些抗原表位组合模式的克隆与原核表达，利用PCR、酶切、序列测定检测基因克隆结果；利用SDS-PAGE技术检测原核表达的结果，检测结果表明获得了序列正确的3种组合模式的抗原肽。4、免疫小鼠，并检测血清抗体效价，在抗体效价达到要求后获取小鼠脾脏B淋巴细胞。5、准备骨髓瘤细胞，并将骨髓瘤细胞与前面制备好的小鼠脾脏B淋巴细胞进行细胞融合。6、进行杂交瘤细胞的克隆化培养，并检测杂交瘤细胞的抗体效价。7、利用Western Blot技术检测抗原的特异性结合，并用ELISA法检测单克隆抗体的抗原性。8、最后进打单克隆抗体亚型的鉴定。本专利技术技术方案带来的有益效果:本专利技术采用单克隆抗体技术制备抗绵羊MSTN基因编码蛋白的单克隆抗体，这种抗体只能特异地与抗原分子上的一个抗原决定簇结合反应，抗体成分均一、抗体的结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，且在培养过程中只要不发生变异，不同时间内分泌的抗体都能保持同样的结构和功能。本专利技术应用于生产实践，免疫绵羊后可以使绵羊MSTN基因失活，从而使绵羊产生双肌表型，大大提高单位绵羊的产肉率。并且利用疫苗免疫的方法，在生产实践中简便易行，易于推广，将有力的促进绵羊养殖业的发展，给企业和农牧民带来巨大的经济效益。下面结合附图和实施例——以绵羊MSTN单克隆抗体疫苗制备为例，对本专利技术做进一步说明。【附图说明】:图1.本专利技术实施例的MSTN单克隆抗体疫苗制备流程图【具体实施方式】:本实施例提供一种运用基因克隆与原核表达方法制备抗原肽，免疫并通过小鼠杂交瘤细胞与单克隆抗体技术制备针对绵羊MSTN基因不同抗原表位组合模式的单克隆抗体疫苗的具体方法。图1显示了绵羊MSTN单克隆抗体疫苗的制备流程。A.运用生物信息学法分析筛选绵羊MSTN基因B细胞抗原表位。下表所不为:绵羊MSTN基因的3种抗原表位组合模式:D6494-lhz-2-b QRDDSSDGSL-Linker-DLLAEVQEKP-Linker-PKRSRRDFGLD6494-lhz-3-c SEQKENVEKK-Linker-KFSSKIQHNK-Linker-1SKDAIRQLL-Linker-K[0031 ] PMKDGTRYT-Linker-LWRQNNKSSRD6494-lhz-4-d RLETAPNISK-Linker-GKIPGMVVDR-Linker-ENGHDLAVTF-Linker-LDMNPGTGIff-Linker-TFPEPGEEGL-Linker-HQANPKGSAG-Linker-PVKTPTTVFVB.串联这些表位，并全基因合成并表达其抗原肽。1)人工分段合成3个MSTN抗原表位组合模式的核苷酸编码序列(见A步骤上表组合模式)，分别命名为D6494-lhz-2-b、D6494-lhz-3-c、D6494-lhz-4-d，其大小分别约为100bp、160bp、300bp的小DNA片段。T4多核苷酸酶磷酸化5’末端，得到5’末端带有BamHI和3’末端带有EcoR I酶切位点的MST本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备绵羊MSTN基因单克隆抗体疫苗的方法，其特征在于，依下述方法步骤进行：(1)利用生物信息学方法分析并筛选绵羊MSTN基因的抗原表位；(2)将这些抗原表位串联成3种组合模式，人工合成这些绵羊MSTN基因抗原表位组合模式；(3)利用基因克隆与原核表达技术分别进行这些抗原表位组合模式的克隆与原核表达，利用PCR、酶切、序列测定检测基因克隆结果；利用SDS?PAGE技术检测原核表达的结果，检测结果表明获得了序列正确的3种组合模式的抗原肽；(4)免疫小鼠，并检测血清抗体效价，在抗体效价达到要求后获取小鼠脾脏B淋巴细胞；(5)准备骨髓瘤细胞，并将骨髓瘤细胞与前面制备好的小鼠脾脏B淋巴细胞进行细胞融合；(6)进行杂交瘤细胞的克隆化培养，并检测杂交瘤细胞的抗体效价；(7)利用Western?Blot技术检测抗原的特异性结合，并用ELISA法检测单克隆抗体的抗原性；(8)最后，进行单克隆抗体亚型的鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种制备绵羊MSTN基因单克隆抗体疫苗的方法，其特征在于，依下述方法步骤进行:(1) 利用生物信息学方法分析并筛选绵羊MSTN基因的抗原表位；(2)将这些抗原表位串联成3种组合模式，人工合成这些绵羊MSTN基因抗原表位组合模式；(3)利用基因克隆与原核表达技术分别进行这些抗原表位组合模式的克隆与原核表达，利用PCR、酶切、序列测定检测基因克隆结果；利用SDS-PAGE技术检测原核表达的结果，检测结...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树伟，
申请(专利权)人：李树伟，
类型：发明
国别省市：