人乳铁蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种人乳铁蛋白单克隆抗体。由保藏号为CGMCCNo.6394的小鼠杂交瘤细胞产生。本发明专利技术还提供所述人乳铁蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。所述单克隆抗体可用于检测转基因牛奶与奶粉中的人乳铁蛋白。本发明专利技术的人乳铁蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，直接对外源表达蛋白进行检测，避免了基因提取费时费力且容易污染的问题；本发明专利技术检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
人乳铁蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用
本专利技术涉及单克隆抗体的制备与应用，尤其涉及一种人乳铁蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
人乳铁蛋白(hLF)是一种多功能的糖蛋白。它的主要功能有:抑菌与杀菌、抗病毒、增强宿主防御和免疫调节工能、促进铁吸收、抗肿瘤生长和转移作用、影响自由基的生成等。作为机体防御组分的hLF不仅可用作药物治疗感染、癌症和免疫低下等病症，还可作为食品添加剂改善人民的健康。由于天然的人乳铁蛋白来源有限，目前还无法开发出产品来满足巨大的市场需求，科学家们正致力于利用转基因技术，特别是转基因动物-乳腺生物反应器生产重组人乳铁蛋白的研究。同时，与转基因相伴而生的生物安全问题引起了公众和管理部门的强烈关注和重视。建立精准、快速的检测技术并科学、系统地进行生物安全评价，可防止转基因动物或产品在研究、生产、销售时发生扩散、污染等安全隐患进行检测和监测技术储备和支撑。这不仅是维护消费者知情权和在国际贸易中维护国家利益的必要手段，也是我国履行国际义务、维护国家形象的重要保障。乳铁蛋白的检测方法有很多，其中ELISA检测法以其快速、准确、灵敏且一次能处理多个样而倍受关注。目前国内外用于ELISA检测的抗体为多克隆抗体，而以单克隆抗体为基础建立起的免疫学检测试剂盒很少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人乳铁蛋白单克隆抗体。本专利技术的另一目的是提供能分泌产生所述人乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术的再一目的是提供人乳铁蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人乳铁蛋白中的应用。本专利技术用重组蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF的4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12。取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞3D12效价最高。3D12细胞亚型为IgGl+kappa。3D12细胞能与免疫原hLF反应，不与筛选原牛乳铁蛋白(bLF)反应。用细胞3D12制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。杂交瘤细胞ZZY hLF 3D12的保藏号为:CGMCC N0.6394 ;保藏时间:2012年7月20日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。所述人乳铁蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人乳铁蛋白。Western Blot检测显示抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。本专利技术还提供以人乳铁蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到人乳铁蛋白多克隆抗体。纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为2mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到I: 200,000。本专利技术还提供人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。其中，检测样本中免疫抗原检测限为25ng/mL。所述人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:I)洗涤液；2)底物显色液； 3)反应终止液；4)人乳铁蛋白标准品。所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。所述试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤:I)向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；2)加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；3)加入底物显色液显色,加入反应终止液终止反应,测定0D450值；4)以人乳铁蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量。具体包括以下步骤:I IgG标准曲线的建立:将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；II检测样品中人乳铁蛋白的含量:将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；加入待检测样品，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。优选地，人乳铁蛋白多克隆抗体浓度为5 u g/mL,包被液为pH9.6磷酸缓冲液，酶标人乳铁蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。具体实施步骤如下:I IgG标准曲线的建立:(I)包被:浓度为5 ii g/mL兔多克隆抗体，100 y L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；(2)封闭:加1501117孔封闭液，371:2小时后，洗涤3次，拍干，置41:冰箱保存备用；(3)加标准样品:混合转基因样品和非转基因样品制备人乳铁蛋白抗原标准品，标准品原始浓度为0.2mg/mL，分别按照 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 稀释，PBS作为阴性对照；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液IOOiI L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；(4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；(5)显色:TMB 按 100 y L/孔加入，37°C显色 15_30min ；(6)终止:加入终止液2M H2S0450 U L/孔；(7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；II检测样品中人乳铁蛋白的含量:(I)包被:浓度为5 ii g/mL兔多克隆抗体，100 y L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；(2)封闭:加1501117孔封闭液，371:2小时后，洗涤3次，拍干，置41:冰箱保存备用；(3)加待测样品:加入待测样品，100 U L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；(4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；(5)显色:TMB 按 100 y L/孔加入，37°C显色 15_30min ；(6)终止:加入终止液2M H2SO4 50 U L/孔;(7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。本专利技术的有益效果:本专利技术的人乳铁蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测，同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。本专利技术可用于转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白的定量检测，根据标准曲线在25~200ng/mL范围内线性良好，本文档来自技高网...

【技术保护点】
人乳铁蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC?No.6394的杂交瘤细胞株产生。

【技术特征摘要】
1.人乳铁蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCCN0.6394的杂交瘤细胞株产生。2.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体经亲和...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱振营，刘建，林祥梅，吴绍强，付伟，李风翠，仇松寅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：