一种治疗头颈部肿瘤单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及的是一种制备治疗头颈部肿瘤单克隆抗体的方法，其特征在于，通过同位素标记，多维液相色谱-质谱联用的方法分析口腔癌前病变细胞样本与口腔粘膜细胞样本找出在癌变细胞中特异表达的头颈部肿瘤标记蛋白，并对这些蛋白进行分离纯化；用分离纯化出来的头颈部肿瘤标记蛋白对6-8周龄的雌性BALB／c小鼠进行免疫，如果抗体滴度在1：10000以上时，可将免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选，得到分泌头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞；向6-8周龄的BALB／c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后10天左右收集腹水，protein?G／A柱子纯化腹水，获得治疗头颈部肿瘤的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】
(—)
:本专利技术涉及生物医药领域，特别是。(二)
技术介绍
:头颈部肿瘤(HNSCC)包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤。涉及鼻腔、鼻窦、唇和口腔、口咽、喉咽、喉部、甲状腺、大唾液腺、鼻咽部。一项流行病学调查表明，癌症已成为造成我国成年人死亡的主要原因之一,而头颈部恶性肿瘤发病率约占全身恶性肿瘤5-7%，由于在早期检测和风险评估时缺乏生物标记，这使得50%以上HNSCC病人在确诊的时候就已经是癌症晚期了。目前还没有用来诊断或预测HNSCC的标记物，因此迫切需要找到蛋白标记物或治疗靶点，从而提高病人的存活率和生存质量。对付HNSCC，关键在于及时发现、尽早干预。目前对于HNSCC的治疗方式主要采用手术和放疗结合的方式，但是这些方式均可能造成相应的功能、外观损害，如进食困难、声音撕哑、丧失语言功能、面瘫、头面部疤痕、色素沉着、甚至头目部畸形等等。而单克隆抗体类药物具有灵敏度高、特异性强、高效、低毒等特点，目前还没有上市的用于治疗HNSCC的抗体药物。Ranju Ralhan, Leroi V.DeSouza等人通过同位素标记、多维液相色谱串联质谱法对HNSCC组织与正常组织中蛋白表达差异的研究，发现三种最好的生物标记:YWHAZ，stratif in，和S100-A7，用它们来区分头颈部癌变组织和非癌变组织时的灵敏度是0.92，特异性是0.91。用免疫组织化学、免疫杂交、RT-PCR对临床上的样本差异表达分析也证明YWHAZ, stratif in,和 S100-A7 在 HNSCCs 中过量表达；Ranju Ralhan, Leroi V.等人通过同位素标记、多维液相色谱串联质谱法及蛋白组学的研究，发现了 HNSCC的两种好的生物标记，stratifin (14-3-3 o )和 YffHAZ (14-3-3 I )，通过对 51 个 HNSCC 病人和 36 个正常人的样本进行免疫组化学研究证明这两种蛋白在HNSCC病人中表达量显著升高；口腔粘膜白斑病是一种异质性病变，很有可能发展成癌症；但是目前还没有生物标记可以预测到这种恶性转变。用同位素标记、多维液相色谱串联质谱法对口腔粘膜白斑组织进行分析表明异质核糖体蛋白KQinRNP K)过量表达。用`免疫组化的方法进行对100个HNOSCCs组织、199个口腔粘膜白斑组织和55个正常组织进行分析，表明口腔粘膜白斑组织比正常组织中hnRNPK含量显著增加(p〈0.001)，口腔粘膜白斑组织比HNOSCCs组织细胞质中hnRNP K含量显著增加(p〈0.001)，我们后序研究中最重要的一个发现是组织细胞质中hnRNP K是一个独立预测HNOSCCs复发的因素。国内的相关研究主要集中在HNSCC的放化疗及流行病学方面。通过同位素标记、多维液相色谱串联质谱法、组织芯片法分析病人的样本，找出HNSCC的几种标记蛋白，制出相应抗体，这样就可以实现用酶联免疫(ELISA)法检测病人体液中的这些标记蛋白，从而在临床上实验微创检测，并可以达到早期诊断的目的；进而进行临床前动物实验，从而达到对HNSCC的有效治疗的目的。(三)
技术实现思路
:本专利技术的目的在于提供一种制备可以有效治疗头颈部肿瘤的单克隆抗体的方法，它针对上述情况，专利技术一种操作简便、成本低廉、高效的制备方法。本专利技术的技术方案:一种制备可以有效治疗头颈部肿瘤的单克隆抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤:(I)收集大量口腔癌前病变细胞样本与口腔粘膜细胞样本，并通过同位素标记，多维液相色谱-质谱联用的方法分析在癌变细胞中特异表达的头颈部肿瘤标记蛋白，对这些蛋白进行测序；(2)完成HNSCC标记蛋白单克隆抗体的表达和纯化；1、用分离纯化出来的头颈部肿瘤标记蛋白进行动物免疫。选择6-8周龄的雌性BALB / c小鼠。按照每只鼠IOOug的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点或腹腔内注射。免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清。间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度。如果抗体滴度在1:lw以上，可以在融合前三天加强免疫，100 ii L的PBS溶解50ug头颈部肿瘤标记蛋白腹腔内注射或静脉注射。否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。2、细胞融合和筛选。为了产生分泌头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介导的条件下融合:脾细胞与骨髓瘤细胞在10:1的比例混合。将细胞的混合物用无血清MDM培养基洗涤至少3次。于37°C水浴中，向细胞团中逐滴加入50% PEG,并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的MDM培养基洗涤I次。用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开,并按200ul / well接种于96孔细胞培养板中。之后，每隔2-3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选。间接法ELISA筛选分泌针对头颈部肿瘤标记蛋白的抗体阳性细胞孔。首次确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在100%，获得可以稳定分泌头颈部肿瘤标记蛋白抗体的杂交瘤细胞株。·3、腹水制备:选择6-8周龄的BALB / c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-10天后注射杂交瘤细胞。注射细胞后10天左右收集腹水，protein G / A柱子纯化腹水，获得纯度较高的头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体。(四)【具体实施方式】:以下将通过【具体实施方式】的形式再对本专利技术的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅局限于以下的【具体实施方式】，凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例1:头颈部肿瘤标记蛋白的获得通过同位素标记、多维液相色谱-质谱联用的方法分析200多个口腔癌前病变细胞样本与200多个正常口腔粘膜细胞样本，找出5-8个在癌变细胞中特异表达的头颈部肿瘤标记蛋白，分离纯化出这几个标记蛋白；实施例2:头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的表达1、用分离纯化出来的头颈部肿瘤标记蛋白进行动物免疫。选择6-8周龄的雌性BALB / (:小鼠。按照每只鼠IOOug的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点或腹腔内注射。免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清。间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度。如果抗体滴度在1:lw以上，可以在融合前三天加强免疫，100 y L的PBS溶解50ug头颈部肿瘤标记蛋白腹腔内注射或静脉注射。否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。2、细胞融合和筛选。为了产生分泌头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介导的条件下融合:脾细胞与骨髓瘤细胞在10:1的比例混合。将细胞的混合物用无血清MDM培养基洗涤至少3次。于37°C水浴中，向细胞团中逐滴加入50% PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的IMDM培养基洗涤I次。用含有HAT的完全培养基重悬融合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备治疗头颈部肿瘤单克隆抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)头颈部肿瘤标记蛋白的分离纯化；(2)头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的表达；(3)头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的纯化。

【技术特征摘要】
1.一种制备治疗头颈部肿瘤单克隆抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤:(1)头颈部肿瘤标记蛋白的分离纯化；(2)头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的表达；(3)头颈部肿瘤标记蛋白单克隆抗体的纯化。2.根据权利要求1所述的一种制备治疗头颈部肿瘤单克隆抗体的方法，其特征在于通过同位素标记、多维液相色谱-质谱联用的方法找出在癌变细胞中特异表达的头颈部肿瘤标记蛋白。3.根据权利要求1所述的一种制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤娟，赵宝娟，王翔，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：