本发明专利技术公开了一种重组人凝血因子FVII-Fc融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白从N端到C端依次包含人FVII、柔性肽接头和IgG2Fc变异体。这种Fc变异体无裂解性，且显示极小的Fc-介导的不良副作用。该融合蛋白具有与人FVII类似或更高的生物学活性和大大延长的血浆半衰期，从而改善药物动力学和药效。
【技术实现步骤摘要】
包含改良型人凝血因子FVI !-Fe融合蛋白的药物组合物
本专利技术涉及一种改良型人凝血因子FVII的Fe融合蛋白及其制备方法和用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
技术介绍
凝血是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块形成的过程，通常参与被称为凝血“级联反应”的血液组分是原酶或酶原，即不具有酶活性的蛋白，在激活剂的作用下使其转变为活性酶。凝血因子FVII就是这些凝血因子中的一种。FVII是一种维生素K依赖性的血浆糖蛋白，在肝脏中合成，并以分子量约为53KDa的单链蛋白酶原形式分泌到血液中(Broze等，J Biol Chem，1980，255:1242-1247)。FVII酶原在单一位点Argl52-1lel53处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为其活性形式FVIIa。单链凝血因子FVII可以通过凝血因子FXa、凝血因子FXIIa、凝血因子FIXa、凝血因子FVIIa或凝血酶在体外水解转化为双链凝血因子FVIIa。活化的FVIIa包含NH2-末端衍生的轻链(~20KDa)和COOH-末端衍生的经由单一二硫键(Cysl35至Cys262)连接的重链(~30KDa)。轻链含有细胞膜结合性Gla结构域和两个EGF结合结构域，而重链含有催化结构域。处于活化形式时，FVIIa作为丝氨酸蛋白酶，参与凝血级联反应的外源性途径(extrinsic pathway)。当血管的脉管内腔受损伤时,外源性凝血路径被启动，细胞膜糖蛋白组织因子(Tissue Factor, TF)被暴露，结合循环性的FVII和已存在的较小量活化FVIIa，这种结合促进FVII全部转化为FVIIa，随后在钙离子和磷脂的协同作用下，使FIX转化为FIXa，FX转化为FXa，继而进一步将凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶在血液凝固和伤口愈合方面起关键作用，在血管损伤的最初阶段，其诱导血小板聚集并诱导纤维蛋白形成，之后刺激细胞生长从而促进受损血管的修复(Osterud等，Proc Natl AcadSci USA,1977,74:5260-5264)。编码人FVII (hFVII)的基因位于13号染色体的q34_qter9，9个外显子组成，长度为 12.8Kb (O，Hara 等，Proc Natl Acad Sci USA，1987，84:5158-5162)。hFVII 包含四个结构域:氨基端Y-羧基谷氨酸(Gla)结构域，两个“类表皮生长因子(EGF)”结构域和羧基端丝氨酸蛋白酶域(催化结构域)。外显子Ia和Ib编码信号肽序列；外显子2编码Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码类表皮生长因子结构域；外显子6至8编码丝氨酸蛋白酶催化结构域(Yoshitake等,Biochemistry, 1985, 24:3736-3750)。成熟FVII蛋白经历多种翻译后修饰，包括维生素K依赖性的羧基化，导致该分子NH2-末端产生10个Y羧基化的谷氨酸残基。其他翻译后修饰包括羟基化(Asp63)、N-型糖基化(Asnl45 和 Asn322)以及 O-型糖基化(Ser52 和 Ser60)。血友病A和B是遗传性疾病，分别是凝血因子FVIII和凝血因子FIX的缺陷而造成的。蛋白替代疗法是血友病A和B的传统治疗方法，包括静脉内给予从人血浆中制备的或基因工程方法获得的重组FVIII或FIX。然而，在血友病A和B的治疗中，存在最严重的医学问题是针对替代凝血因子的同种抗体(alloantibody)的产生，这导致治疗效力降低或者使治疗无效。所有血友病A患者中产生针对凝血因子FVIII抗体高达30%，而针对血友病B产生凝血因子FIX抗体发生几率较小，但具有更严重的后果，因为它们对免疫耐受性诱导疗法较不敏感。在血友病治疗中使用FVIIa是基于FVIIa对于凝血酶活化的血小板表面的低亲和性结合，通过给予药物学剂量的外源性FVIIa，使损伤位处血小板表面上的凝血酶产生被增强，这与FVIII/FIX的存在无关，即绕开对于凝血因子VIIIa和凝血因子IXa的需求来达到止血。因此，FVIIa可用于存在有抑制物的血友病患者的出血性状况的治疗。FVIIa还被用于治疗先天性FVII缺陷的患者。另外，FVIIa越来越多地被用做适应症外使用(off-lable use)，如治疗与非血友病患者中先天性或获得性出血性疾病，外伤或手术相关的出血。鉴于血浆FVII的来源有限，且伴有病毒感染的风险。重组FVII已成为研发重点之一。有报道FVII在BHK细胞或其它哺乳动物细胞中的有效表达(W09215686，W09111514，W08810295)，并在纯化过程中将其转变成活化的FVIIa。专利FR0604872还描述了利用转基因动物制备FVIIa的方法。市售的重组凝血因子FVIIa目前只有NovoSeven?i (NovoNordisk，丹麦)。该药已在全世界范围内被批准用于治疗具有因产生FVIII或FIX抗体(抑制剂)的血友病A或B患者，先天性FVII缺陷的患者和终止与外伤和/或手术相关的出血事件或预防出血。治疗性凝血蛋白药物包括FVIIa在内会被蛋白水解酶快速降解，并且易被抗体中和，这会降低它们的半衰期和体内循环时间，由此限制了它们的疗效。在“Smnmary Basisfor Approval NovoSeven?”(FDA参考号96-0597)中报道了重组FVIIa在人体内循环半衰期为2.3小时，而相对高的剂量和频繁给药对于达到并维持期望的疗效和预防效果是必须的，这导致极高的治疗成本以及患者治疗的不便。迄今，还没有商品化的具有延长血浆半衰期的重组FVIIa。由于凝血因子FVII/VIIa具有作为通用止血剂的潜能，因此仍然存在开发具有更长的体内功能半 衰期(functional half-life)FVII的临床需求。目前有多种策略应用于改善FVII药动学特性，延长其体内半衰期。如与脂类或PEG结合。Novo Nordisk公司正在开发的糖聚乙醇二醇化FVIIa(参见专利US20050113565和US8053410)和PCT申请TO2008074032还提及一种具有延长体内半衰期的FVIIa-聚唾液酸结合物。此外，已公开的其它方法还有增加糖基化位点，比如Bayer公司正在开发的高糖基化FVIIa，T106N和V253N 点突变(参见专利 US20060252128、EP1549677B 和 US20100260741)或 CSL Behring公司正在开发的FVIIa-白蛋白融合蛋白(参见专利TO2007090584)。美国Prolor Biotech公司正在开发的一种长效凝血因子FVII，将hCG的羧基肽(Carboxy-terminal，CTP)连接至凝血因子FVII的羧基端获得了具有延长半衰期的FVII (参见专利US20100317585)。IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天，而Fe片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。大量研究已证实IgG的Fe片段与活性蛋白连接构成融合蛋白，可以提高活性蛋白的体内半衰期，这种方法已被用于一些临床上很重要本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、辅形剂或稀释剂，以及有效剂量的重组hFVII?L?vFc融合蛋白，该融合蛋白从N端到C端依次含有人FVII、柔性肽接头和人IgG?Fc，其中，所述人IgG?Fc包括天然人IgG?Fc及人IgG?Fc变异体。
【技术特征摘要】
1.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、辅形剂或稀释剂，以及有效剂量的重组hFVI1-L-vFc融合蛋白，该融合蛋白从N端到C端依次含有人FVI1、柔性肽接头和人IgG Fe，其中，所述人IgG Fe包括天然人IgG Fe及人IgG Fe变异体。2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述人IgGFe是含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域的Fe变异体，所述的人FVII是天然FVII或具有相似功能的FVII变异体，所述的肽接头含有2-20个氨基酸，存在于hFVII和人IgG Fe之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸，优选GlySerGlyGly...
【专利技术属性】
技术研发人员：李强，刘长付，冯维，武翠，孙见宇，孙乃超，
申请(专利权)人：安源生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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