本发明专利技术一般地涉及益生菌领域。特别地，本发明专利技术涉及缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌（Lactobacillus?johnsonii）菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物本专利技术一般地涉及益生菌领域。特别地，本专利技术涉及缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株 CNCM 1-1225 的天然衍生物。人分离株约氏乳杆菌CNCM 1-1225也称为约氏乳杆菌NCC533或者嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) La1、或者约氏乳杆菌 Ljl (Bernet-Camard, M.F.，等人，(1997) Appl.Environ.Microbiol.63，2747-2753)是目前非常成功地以商标Lcl商品化的益生菌。约氏乳杆菌CNCM 1-1225具有几种明确记录的健康益处，例如，免疫调节或病原体抑制的活性(Haller，D.，等人，2000，Infect.1mmun.68:752-759 ；Haller, D.，等人，2000，Gut47:79-87 ;或 Ibnou-Zekri, N.，等人，2003，Infect.1mmun.71:428-436)和长期的安全使用历史。限制约氏乳杆菌CNCM 1-1225在一些产品种类，例如在用于幼儿和婴儿的产品中的应用的一个方面是从糖的发酵中主要地产生了 D-乳酸同分异构体。例如，如果在MRS培养基中培养，那么约氏乳杆菌CNCM1-1225将乳糖发酵成60%: 40%比例的D-和L-乳酸。由于3岁以下婴儿有限的D-乳酸消除(这可能导致D-乳酸中毒)，所以CODEXInfant Formula Directive对3岁以下婴儿消费的D-乳酸和产生D-乳酸的细菌给出了建议。支持该结论的证据是有限的，并且所述证据主要是基于食物中D-乳酸的存在，并且没有基于产生D-乳酸细菌(其是胃肠道的天然寄居菌)的施用。因此，几篇文献对该观点`提出了质疑(Connolly，E.等人，NTRAfoods3 (3),37-49,2004 ；Haschke-Becher, E.，等人，2008, Ann.Nutr.Metab.53:240-244, Mack, D.R.,2004,Can.J.Gastroenterol.18:671-675),但到目前为止，CODEX Infant Formula Directive的建议仍没有改变。CODEX基本上排除了将产生D-乳酸的益生菌作为婴儿配方食品中的补充剂，但鼓励只产生L-乳酸的菌株的遗传改造。此类研发的实例是产生经遗传修饰的生物(GM0)，特别是经遗传修饰的约氏乳杆菌菌株，其中分离了 d-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因(ldhD)，并通过基因替换，将IdhD基因体外截短的克隆拷贝用于失活基因组拷贝(Lapierre，L.，等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.65:4002-4007)。产生的这种经遗传改造的菌株仅用于实验室目的，并且从未用于食品中，因为使用重组DNA技术，已经改变了所述菌株的遗传物质，因此认为该菌株是GM0。然而，期望存在这样的可能性，允许约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的大量健康益处也可用于目前并不建议消费D-乳酸或者产生D-乳酸的细菌的个体。因此，本领域存在天然益生菌菌株，特别是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的强烈需求，所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物缺失了 D-乳酸产生，但尽管如此仍可存活。本专利技术人处理了这些需求。因此，本专利技术的目的是为本领域提供约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物，其还可以应用于婴幼儿产品，同时考虑CODEX Infant Formula Directive的当前规则,所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物是天然的且不会被认为是GM0。本专利技术人惊讶地发现，他们可以通过独立权利要求的主题实现本专利技术的目的。从属权利要求进一步发展了本专利技术的理念。本专利技术人研究了分离天然的(非GM0)、活的和遗传上稳定的约氏乳杆菌Lal的变体的可能性，所述约氏乳杆菌Lal的变体只产生L-乳酸。基因组序列的改变以相对低的频率天然地发生，例如由于损伤DNA的错误修复或者DNA复制错误而发生。为了寻找约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的此类天然衍生物，本专利技术人筛选了大约21-000个约氏乳杆菌CNCM 1-1225菌落，并且已经鉴定了两个可以实现本专利技术的目的的天然D-乳酸缺失变体。本专利技术人还测定了 MRS培养上清液中的D-和L-乳酸浓度，并且显示与培养上清液中总的乳酸浓度相比，相对的D-乳酸浓度低于4% ;特别地，在一种情况下3.7%，并且在第二种情况下0%。DNA序列分析鉴定了乳酸脱氢酶基因中主要的点突变，所述点突变改变了酶的氨基酸序列，因此改变了酶的催化性质。两种天然衍生物都显示是可存活的并且稳定的，并且没有回复突变至D-乳酸产生的实例。因此，本专利技术的一个实施方案是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物缺失D-乳酸产生。据本专利技术人了解，这是第一次提供了缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物。对于本专利技术的目的，“缺失D-乳酸产生”指的是与总乳酸生产量相比，菌株产生少于5%，优选地少于4%，和理想地0%的D-乳酸。可以在无细胞培养上清液中测量D-和L-乳酸浓度。由约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物产生的乳酸的总量最初与细胞生长相关。当细胞进入稳定期并停止分裂时，它们继续代谢糖并产生更多的乳酸。然而，发现产生的D-和L-乳酸的比例是恒定的。约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的“天然”衍生物指的是不认为是GMO的菌株。例如可以通过筛选经历了天然发生的基因组序列改变(例如，由于损伤DNA的错误修复或者DNA复制错误)的菌落，来获得此种天然衍生物。通过使菌落经历胁迫条件，例如通过应用甲磺酸乙酯，EMS可以增加这种错误的天然发生。对于本申请的目的，术语“GM0”应当根据2001年3月12日的DIRECTIVE2001/18/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL对于故意将经遗传修饰的生物释放到环境中和撤销的Council Directive90/220/EEC定义。因此，‘经遗传修饰的生物(GM0)’指的是除人类之外的这样的生物，其中遗传物质已经通过非天然发生(交配和/或非天然重组)的方式而改变。 就该定义而言，至少通过使用以下技术发生遗传修饰:(I)重组核酸技术，其涉及通过将以生物之外的任一种方法产生的核酸分子插入到任一种病毒、细菌质粒或其他载体系统中来形成遗传物质的新组合，并且将所述遗传物质的组合掺入到它们并非天然存在，但能继续增殖的宿主生物中；(2)涉及将在生物之外制备的可遗传物质直接引入到生物中的技术，其包括显微注射法、巨量注射法和微囊化作用；或(3)细胞融合(包括原生质体融合)或杂交技术，其中使用并非天然存在的方法，通过融合两个或多个细胞形成具有可遗传的遗传物质的新组合的活细胞。如果菌株具有至少99.95%，例如至少99.99%，优选地至少99.995%的核酸同一性，那么认为菌株是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
约氏乳杆菌菌株CNCM?I?1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM?I?1225的衍生物缺失D?乳酸产生。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.29 EP 11160146.41.约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的衍生物缺失D-乳酸产生。2.权利要求1的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的D-乳酸脱氢酶序列在氨基酸位置153处包含甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸改变和/或在氨基酸位置204处包含丝氨酸至亮氨酸的氨基酸改变。3.权利要求1或权利要求2的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中的D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列在核酸位置498处包含G至A的转变和/或在核酸位置651处包含C至T的转变。4.权利要求1-3中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其选自约氏乳杆菌菌株CNCM 1-4434和约氏乳杆菌菌株CNCM 1-4441。5.权利要求1-4中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以生物学上纯的培养物存在。6.无细胞培养上清液，其分离自权利要求1-4中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物的生物学上纯的培养物。7.包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或权利要求6的无细胞培养上清液的组合物的用途，用于制备在通过治疗处理人体或动物体的方法中使用的组合物。8.包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或权利要求6的无细胞培养上清液的组合物的用途，用于治疗或预防与减弱的免疫系统相关的病症。9.权利要求8的组合物的用途，其中所述与减弱的免疫系统相关的病症选自流感、鼻炎、普通感冒及其组合。10.包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或权利要求6的无细胞培养上清液的组合物的用途，用于治疗或预防与肠道毒性细菌或病毒的细胞附着和细胞入侵相关的疾病。11.权利要求10的组合物的用途，其中所述与肠道毒性...
【专利技术属性】
技术研发人员：RD·普里德莫尔，F·法塔，M·戴雷，I·扬科维奇，
申请(专利权)人：雀巢产品技术援助有限公司，
类型：
国别省市：
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