本发明专利技术提供了一种利用德氏乳酸乳杆菌发酵产乳酸的方法，通过对菌株培养条件的研究，确定了菌株最适的发酵培养条件：好氧环境下培养平板，种龄16h，接种量10%，装液量120mL、250mL，45℃静置培养，发酵液初始pH值为6.0,发酵6h后一次性添加50g/L的碳酸钙。此最优条件下发酵可以提高葡萄糖的转化率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于发酵
，具体涉及。
技术介绍
乳酸是一种重要的有机酸，学名a -羟基丙酸，在分子结构中有一个不对称碳原子，因此乳酸存在两种异构体，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作为一种重要的生物化工原料，L-乳酸被广泛应用于食品、医药、现代农业、日用化工、有机化工等领域，覆盖大量产品。乳酸可以通过化学合成或碳水化合物发酵得到，但是基于发酵法能够专一性地得·到L-乳酸或D-乳酸，因此发酵法被广泛用于L-乳酸的生产。乳酸杆菌发酵生产乳酸具有光学纯度高、发酵强度显著提高等特点，因此，利用乳酸杆菌发酵生产乳酸成为大规模生产L-乳酸的趋势。目前用于乳酸生产的原料主要有淀粉、糖蜜、乳清粉等。为了降低乳酸的制备成本，提高乳酸生产质量，国内外对乳酸生产的研究，主要集中在低价原料的开发利用、提高发酵强度、优化乳酸分离提取工艺这三个方面。发酵法生产乳酸最早见于1841年的Boutron和Fremy的记载中，其生产方法是将麦芽或酸乳放入淀粉或牛乳中使其自然发酵，然后用碳酸钙逐渐中和所产生的乳酸。实际的工业生产始于1881年的美国阿伏利公司，其以玉米、小麦、大米、红薯等淀粉为原料，首先将淀粉糖化，加入碳酸钙，然后加入乳酸菌发酵3-6天。工业上常用德氏乳酸乳杆菌发酵，其对糖的转化率高达90%以上，产品主要为DL-乳酸。常用于工业生产乳酸的细菌主要有乳杆菌属、明串株菌属、链球菌属。由于有些乳酸细菌能产生淀粉酶，所以应用这类细菌发酵淀粉质废弃物，不必进行糖化，可以直接发酵，有利于工艺的简化。已报道的能水解淀粉的乳酸细菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、解淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌和嗜淀粉乳杆菌等。目前工业上普遍采用的是德氏乳酸乳杆菌和嗜热乳杆菌。发酵是一种复杂的生化过程，受很多因素的影响，如菌体自身的生产性能、培养基的配比、种子的质量、发酵条件和发酵过程控制等都与目的产物的产出有密切的关系。在工业生产中，为了最大限度的发挥菌体的生产能力，应该提供最优的生产培养基和培养条件。因此，探索菌株高产特性充分表达的最优培养条件是发酵生产的基础和关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了，通过探索德氏乳酸乳杆菌发酵产乳酸的最优培养条件及培养方法，使乳酸产量达到很高的水平，为进一步利用高葡萄糖含量的廉价的碳源提供基础。I. ，其特征在于将第三代种子液按10%(v/v)比例接入装有150mL发酵培养基的250mL的医用葡萄糖注射瓶中，45°C静置培养72小时，发酵初期加入一定量的碳酸钙。2.步骤I所描述的方法，具体步骤如下 (I)用接种环从菌株冷藏斜面挑取一菌环接种到装有60mL MRS活化液体培养基的IOOmL密封玻璃瓶中，420C，150rpm,密封培养24h。(2)第三代种子液的制备是以无菌吸管按5% (v/v)比例将MRS培养液转接于种子培养基中，42°C，150rpm密封培养24小时，重复转接三次，种子培养基的体积可根据实验需要逐步增大。(3)将第三代种子液按15% (v/v)比例接入装有150mL发酵培养基的250mL的医用葡萄糖注射瓶中，45°C静置培养72小时，发酵初期加入一定量的碳酸钙。·3.步骤2所述MRS活化液体培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏4，蛋白胨10，牛肉膏 8，吐温 80 ImLjKH2PO4 2, NaAc 5，柠檬酸二铵 2,MgSO4 0. 2,MnSO4 0. 04，蒸馏水 1000mL。4.步骤2所述的纯糖种子培养基(％):葡萄糖5%，蛋白胨0. 5%，酵母粉0. 5%,MgSO40. 05%, NaCl 0. 01%, KH2PO4 0. 05%。5.纯糖发酵培养基(％):葡萄糖8%，蛋白胨0. 5%，蛋白粉0. 5%，MgSO4 0. 05%, NaCl0. 01%, KH2PO3 0. 05%。6 步骤2 (2)所述的最优种龄为14h。7.步骤2 (3)所述的最优接种量为15%。8 步骤2 (3)所述的最适pH为6.0。9.步骤 2 (3)所述的 CaCCU^加量 60g/L。附图说明图I不同接种量与乳酸产量之间的关系。图2不同初始pH值与乳酸产量之间的关系。具体实施例方式下面的实施例对本专利技术作详细说明，但对本专利技术没有限制。本专利技术使用的菌株德氏乳酸乳杆菌{Lactobacillus delbrueckii )购买自上海艾研生物科技有限公司(菌株号2793ACCC10183)。实施例I 本实施例说明不同种龄的种子对发酵产乳酸的影响，采用10、12、14、16、18小时五个时间段的种子液进行发酵研究，接种量均为15%。探讨不同种龄的种子对乳酸产量的影响。种龄是指种子罐中培养的菌体转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间，选择合适的接种种龄非常重要。由表I可知，接种量为15%，种龄为14h的种子产酸效果最好。表I不同种龄的种子对乳酸发酵的影响种龄(h)IlO |12 |14 |16 |18最终乳酸产量(g/L) |25. 3|30. 6丨38. 9丨35. 2|29. 8 实施例2 本实施例说明不同接种量对发酵产乳酸的影响，将已经活化三代的种子液以1%、5%、10%、15%、20%、25%接种量转接入150mL纯糖发酵培养基中进行发酵培养，发酵72h后测定乳酸的产量。由图I可以看出，当接种量为15%时得到的乳酸产量最高，当接种量分别为1%、5%、10%及15%时，发酵液中的最终乳酸的产量是随着接种量的增加而增加的，说明加大了接种量，乳酸菌的浓度增高，有利于乳酸的快速进行；接种量在20%、25%时，发酵液中的乳酸产量反而下降，可能是随着接种量的增加，由种子培养基中带来的代谢废物增多，且菌体生长过快，细胞衰亡加速，从而影响乳酸产量。实施例3本实施例说明不同发酵液初始PH值对菌体发酵产乳酸的影响，调节纯糖发酵培养基的初始pH值分别为4. O、4. 5、5. O、5. 5、6. O、6. 5、7. 0，发酵72小时后测定发酵液乳酸含量。微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH值通常是不一样的，这不仅与菌种特性有关，也与产物的化学性质有关。由图2可知，在初始pH值为6. 0时，乳酸的产量相对较高，因此，本文将发酵培养基初始最适pH值定为6.0。实施例4本实施例说明碳酸钙的不同添加量对发酵产乳酸的影响，在上面其他最优条件下，在纯糖发酵培养基中分别添加20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L及70g/L的CaCO3进行发酵培养，测定乳酸产量。有表2可见，随着CaCO3浓度的加大，乳酸的产量逐渐上升，超过60g/L时开始下降，可以认为当CaCO3浓度达到60g/L时，基本可以满足条件发酵液中pH值的要求。表2碳酸钙浓度对乳酸发酵的影响权利要求1.，其特征在于将第三代种子液按10%(v/v)比例接入装有150mL发酵培养基的250mL的医用葡萄糖注射瓶中，45°C静置培养72小时，发酵初期加入一定量的碳酸钙。2.权利I所述的方法，其具体步骤如下 用接种环从菌株冷藏斜面挑取一菌环接种到装有60mL MRS活化液体培养基的IOOmL密封玻璃瓶中，42°C，150rpm，密封培养24h ； 第三代种子液的制备是以无菌吸管按5% (v/v)比例将MRS培养液转接于种本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用德氏乳酸乳杆菌发酵产乳酸的方法，其特征在于将第三代种子液按10%（v/v）比例接入装有150mL发酵培养基的250mL的医用葡萄糖注射瓶中，45℃静置培养72小时，发酵初期加入一定量的碳酸钙。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，
申请(专利权)人：苏州百趣食品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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