本发明专利技术公开了一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术利用与PP65具有特异性的适配子，应用生物芯片技术检测HCMV?PP65抗原，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高了PP65检验效率。针对传统检测方法检测时间长、受临床应用限制、检测费用高等问题，采用生物芯片快速检测PP65，能在早期预测HCMV病。本发明专利技术具有流程少、操作简单、检测时间短、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，属于分子生物学领域。本专利技术利用与PP65具有特异性的适配子，应用生物芯片技术检测HCMV?PP65抗原，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高了PP65检验效率。针对传统检测方法检测时间长、受临床应用限制、检测费用高等问题，采用生物芯片快速检测PP65，能在早期预测HCMV病。本专利技术具有流程少、操作简单、检测时间短、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础。【专利说明】一种基于生物芯片快速检测PP65的方法
本专利技术涉及人巨细胞病毒的检测方法，尤其涉及一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
人巨细胞病毒(hyMan cytomegalovirus, HCMV)属于疱疫病毒科乙组疱疫亚科，是一种双螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中广泛传播，病毒长期潜伏于宿主细胞，呈隐性感染。当妊娠，易造成胎儿宫内感染，导致流产、早产、死胎或胎儿先天畸形；当骨髓移植，肝、肾、心脏等器官移植患者免疫功能受损时，潜伏病毒被激活、增值而发生严重感染，将导致患者器官移植失败甚至死亡。近年来，有研究表明巨细胞病毒感染与一些炎症性疾病和增殖性疾病有着密切的关系，包括某些心血管疾病和癌症。现今，巨细胞病毒感染已对人类健康造成极大的威胁，故对HCMV感染的早期诊断显得尤为重要。研究表明，一旦出现HCMV感染的临床症状，抗病毒药物不能控制该病的病理进程，这意味着抗病毒药物必须在HCMV感染的临床症状出现前就使用，这就有赖于实验室的分析。在HCMV实验检测技术中，病毒分离是检测的金标准，但耗时长，结果受标本保存时间影响大。抗体检测需在患者感染一定时间后才可以检出，受患者自身免疫状态影响较大，且不能区分潜伏感染和活动性感染。抗原血症检测技术是一项快速、敏感的诊断技术，但是传统检测方法多以白细胞为病毒抗原检测载体，限制了其临床应用。而核酸诊断其敏感性与特异性均佳，但检测费用高且核酸提取方法还有待改进。PP65是HCMV病毒复制的早期蛋白，它出现于病毒感染的早期，在细胞感染后3-4小时即开始出现，是HCMV病毒含量最丰富的蛋白。其功能是将病毒的DNA锚定在受感染细胞的核膜上，在胞浆的高尔基体内合成，然后运回核内。随着研究的深入，HCMV-PP65抗原被认为是HCMV感染表达的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期预测HCMV病。HCMV常规病毒培养(CCC)往往需要4周才能获阳性结果，对早期诊断帮助不大。HCMV特异性抗体IgM，在严重免疫抑制患者可不出现或延迟出现。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于生物芯片快速检测PP65的方法。本专利技术的技术方案如下:一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，包括以下步骤:(I)取两张晶芯基因芯片，用Binding buffer将IOOng FITC绿色荧光标记PP65巨细胞病毒抗体2稀释至100 μ L，并加入等体积的DMS0，然后点样于基因芯片中央，37°C孵育10?14小时；(2)取出玻片，用 Washing buffer 清洗 3 ?5 次，加入 80 ?100 μ L0.1 ?0.3%BSA封闭12小时以上；(3)取出玻片，用Washing buffer清洗3?5次，加入待检样品，37°C孵育10?14小时；(4)用Washing buffer清洗3~5次,加入I~3 μ M HEX红色突光标记的与人巨细胞病毒PP65抗原具有特异性的适配子，37°C孵育10~14小时，所述适配子为SEQ IDN0.1~SEQ ID N0.6的序列之一；【权利要求】1.一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，包括以下步骤: (1)取两张晶芯基因芯片，用Bindingbuffer将IOOng FITC绿色荧光标记PP65巨细胞病毒抗体2稀释至100 μ L，并加入等体积的DMSO，然后点样于基因芯片中央，37°C孵育10~14小时； (2)取出玻片，用Washingbuffer清洗3~5次，加入80~IOOyL0.1~0.3%BSA封闭12小时以上； (3)取出玻片，用Washingbuffer清洗3~5次，加入待检样品，37°C孵育10~14小 时； (4)用Washingbuffer清洗3~5次,加入I~3 μ M HEX红色突光标记的与人巨细胞病毒PP65抗原具有特异性的适配子，37°C孵育10~14小时，所述适配子为SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.6的序列之一； (5)用Washingbuffer清洗3~5次，荧光显微镜下观察；如果待检样品中有PP65抗原，则在显微镜下既能看到红色荧光又能看到绿色荧光；如果待检样品中没有PP65抗原，则在显微镜下只能看到红色荧光，不能看到绿色荧光。2.根据权利要求1所述的一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，其特征在于:步骤(4)中所述适配子SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.6的二级构象依次分别为: 3.根据权利要求1或2所述的一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，其特征在于:所述的 Binding buffer 为:PBS, 5mM MgCl2, 0.05%tween-20, ρΗ7.5。4.根据权 利要求1或2所述的一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，其特征在于:所述 Washing buffer 为:PBS, 5mM MgCl2, 0.01%tween_20, ρΗ7.5。【文档编号】G01N33/569GK103558380SQ201310549370【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日 【专利技术者】张波, 王永虎, 夏宇 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，包括以下步骤：（1）取两张晶芯基因芯片，用Binding?buffer将100ng?FITC绿色荧光标记PP65巨细胞病毒抗体2稀释至100μL，并加入等体积的DMSO，然后点样于基因芯片中央，37℃孵育10～14小时；（2）取出玻片，用Washing?buffer清洗3～5次，加入80～100μL0.1～0.3%BSA封闭12小时以上；（3）取出玻片，用Washing?buffer清洗3～5次，加入待检样品，37℃孵育10～14小时；（4）用Washing?buffer清洗3～5次，加入1～3μM?HEX红色荧光标记的与人巨细胞病毒PP65抗原具有特异性的适配子，37℃孵育10～14小时，所述适配子为SEQ?ID?No.1～SEQ?ID?No.6的序列之一；（5）用Washing?buffer清洗3～5次，荧光显微镜下观察；如果待检样品中有PP65抗原，则在显微镜下既能看到红色荧光又能看到绿色荧光；如果待检样品中没有PP65抗原，则在显微镜下只能看到红色荧光，不能看到绿色荧光。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张波，王永虎，夏宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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