乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用技术

本发明专利技术公开了乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用，属于食品生物技术领域。该方法利用从泡菜中筛选的乳酸菌LactobacillusplantarumDy-1，CGMCC?No.6016，作为发酵菌株；优化发酵条件，以获得具有抗肿瘤效果和较高产量的LFWGE；采用该提取物进行了多种人源肿瘤细胞及其荷瘤动物试验，结果表明其提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的功能；并对发酵提取物的组成进行了分析，其中富含醌类、糖类、蛋白质和多肽类等。本发明专利技术对麦胚进行简单预处理（非高温加热），生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。?

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用，属于食品生物
。该方法利用从泡菜中筛选的乳酸菌LactobacillusplantarumDy-1，CGMCC?No.6016，作为发酵菌株；优化发酵条件，以获得具有抗肿瘤效果和较高产量的LFWGE；采用该提取物进行了多种人源肿瘤细胞及其荷瘤动物试验，结果表明其提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的功能；并对发酵提取物的组成进行了分析，其中富含醌类、糖类、蛋白质和多肽类等。本专利技术对麦胚进行简单预处理（非高温加热），生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。【专利说明】乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用
本专利技术涉及食品生物
，特指以小麦胚芽(简称麦胚)为原料，通过乳酸菌发酵，实现营养物质的生物转化，制备具有抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的发酵麦胚提取物(LFWGE)，该专利技术产品可用于功能性食品或药物的制备。
技术介绍
目前，中国因恶性肿瘤导致死亡的人数占全球的1/4，且数量仍在不断攀升。而对于癌症的治疗主要有手术、化疗、放疗及祀向疗法(免疫疗法、基因疗法、血管生成抑制剂及定向疗法)等方式，其副作用仍会给患者带来许多痛苦。因此，开发天然安全、无毒副作用的抗肿瘤活性物质及其功能食品是癌症患者的渴求。麦胚是小麦籽粒的生命源泉，占籽粒总重的2%?3%，是小麦制粉加工的副产物之一。其富含优质的蛋白质、脂肪、多种维生素、矿物质及其他一些微量生理活性成分，被营养学家们誉为“人类天然的营养宝库”，因而，麦胚的开发利用一直受到国内外的广泛关注。近年来，在美国、加拿大和日本等国家，麦胚不仅被广泛地加工成各种健康食品，利用微生物发酵麦胚获得具有一定生理功能的提取物已成为新的研究热点，而国内相关研究则相差甚远。日本专利(200510069392.8)公开了一种抗肿瘤制剂的制备方法。该方法是将麦胚芽、大豆胚芽、米胚芽等以一定的比例混合，将混合物用110°c热蒸汽加热，并将蒸汽加热产物在30°C下用曲类(小麦曲霉)等发酵48h，所得的发酵提取物具有抗肿瘤效果，其抑制率在5%?15%，该专利未对发酵提取物中的抗肿瘤成分进行分析。匈牙利专利(99/08694)公开了一种以2，6_ 二甲氧基对苯醌为活性物质的检测方法及其抗肿瘤产品(Avemar)。该方法是将麦胚粉碎，用商用面包酵母发酵，将上清液进行冷冻干燥或喷雾干燥，以其干燥粉配制成一定浓度的水溶液加入到肿瘤细胞中，能够抑制肿瘤细胞的代谢和转移。并以氯仿或乙醇提取其中的2，6-二甲氧基对苯醌为标志物，采用HPLC进行定量。此外，未对提取物的其它成分进行分析。美国专利(2010/135580A2)采用面包酵母对新鲜麦胚进行发酵，将其上清液冷冻干燥成粉，干燥粉用乙醇提取并通过分子筛和电泳等方法获得多肽，相对分子质量在5?100KD之间。采用该范围的多肽进行肿瘤细胞和荷瘤动物试验，具有减少肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖作用。上述日本专利是采用小麦曲霉发酵多种胚芽获得的抗肿瘤混合发酵提取物，匈牙利和美国专利则是采用面包酵母发酵麦胚获得的抗肿瘤发酵提取物，而采用乳酸菌发酵麦胚获得抗肿瘤提取物尚未见专利或其他文献报道。本专利技术采用自行分离的乳酸菌和商用酵母菌中筛选出优良的出发菌株，优化发酵条件，以获得具有抗肿瘤效果和较高产量的LFWGE ;采用该提取物进行了多种人源肿瘤细胞及其荷瘤动物试验，结果表明其提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的功能；并对发酵提取物的组成进行了分析，其中富含醌类、糖类、蛋白质和多肽类等。
技术实现思路
本专利技术提供的是一种以新鲜麦胚为原料，通过乳酸菌发酵，从中提取、分离、纯化获得具有抑制肿瘤细胞增殖活性的LFWGE的制备方法及其应用技术。采用乳酸菌发酵麦胚，控制发酵条件，获取发酵提取物，并对其进行分离纯化；采用MTT、细胞凋亡和细胞周期法研究其组分的体外抗肿瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型(人源肿瘤细胞)研究该提取物体内抗肿瘤功能；综合评价本专利技术LFWGE的抗肿瘤特性。本专利技术通过以下步骤实现:(I)菌种的筛选:从泡菜中筛选出I株乳酸菌(Lactobacillus pi an tarum Dy-1,保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2012年4月18日；保藏编号=CGMCCN0.6016;分类命名:植物乳杆菌Lactobacillus plantarum),选择其作为发酵菌株；或者是选择商业上已鉴定好的优良乳酸菌(植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus case)一种或几种。(2)麦胚发酵:称取筛分除杂后的新鲜麦胚，粉碎过30?80目筛，置于锥形瓶中，按照重量比1:6?1:15比例，优选1:7的比例加入蒸馏水，再加入乳酸菌到麦胚中，其中乳酸菌占新鲜麦胚粉的质量为2?8%，混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20?40°C下发酵12?72h，其中优选发酵温度30?35°C，发酵24?48h后，发酵物在室温下 8000 ?15000rpm/min 离心 10 ?40min,其中优选 10000 ?12000rpm/min 离心 20 ?30min;收集上清液，并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到 LFWGE。或者进一步按照下述步骤进行:LFffGE的分离纯化与分析:采用高效液相(流动相是甲醇与水的比例按照20%?15%,流速为lmL/min,柱温为25°C,检测波长为288nm。)、凝胶过滤层析(SephadexG-50和SurpedexS-200)、SDS-PAGE (5%的浓缩胶，10%?12%的分离胶)等技术对发酵麦胚提取物中的抗肿瘤主要组分进行分离纯化，并通过体外抗肿瘤试验，确证LFWGE中抗肿瘤的主要组分(蛋白质、多肽)。上述具有抗肿瘤活性食品的应用将本专利技术的LFWGE以一定的比例直接加入到发酵乳制品以及其他酸性饮料中，制成功能性饮料；也可将其加入固体食品的制作中，如面包、面条、香肠以及饼干等。将本专利技术的LFWGE加入到食品中并无特别的重量要求，加入量一般优选1%?15%，优选4%?10%。本专利技术的优点:( I)本专利技术以小麦制粉过程中的副产物一麦胚为原料，来源广、蕴藏量大，通过对其生物转化，将大大提升小麦加工副产物深加工的水平，引导企业应用现代生物技术生产健康、闻值化的广品。(2)本专利技术对麦胚进行简单预处理(非高温加热)，生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。(3)本专利技术利用自主分离的乳酸菌，制备具有抗肿瘤功能的发酵提取物，具有自主知识产权。(4)本专利技术对从提取物中的两组蛋白质的抗肿瘤功能进行了研究，确定其低分子量组分具有显著的抗肿瘤功效。【专利附图】【附图说明】图1LFWGE对结肠癌HT-29细胞的生长抑制率，图2细胞凋亡图谱，图3LFWGE浓度对结肠癌细胞周期的影响，图4LFWGE水溶性蛋白SDS-PAGE图谱，图5凝胶过滤层析多肽图本文档来自技高网...

【技术保护点】
乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）菌种的筛选：从泡菜中筛选出1株乳酸菌(?Lactobacillus?plantarum?Dy?1，CGMCC??No.6016)，鉴定其功能特性，选择其作为发酵菌株；或者是选择商业上已鉴定好的优良乳酸菌（植物乳杆菌（lactobacillus?plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus?brevis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus?acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus?case）一种或几种；（2）麦胚发酵：称取筛分除杂后的新鲜麦胚，粉碎过30～80目筛，置于?锥形瓶中，按照重量比1:6~1:15比例，优选1:7的比例加入蒸馏水，再加入乳酸菌到麦胚中，其中乳酸菌占新鲜麦胚粉的质量为2~8%，混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20～40℃下发酵12～72h，其中优选发酵温度30～35℃，发酵24～48?h后，发酵物在室温下8000～15000rpm/min离心10～40min，其中优选10000～12000rpm/min离心20～30min；收集上清液，并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到LFWGE。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董英，张家艳，徐斌，周兴华，肖香，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：