npp1融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供了一种新颖的融合多肽，该多肽包含融合到一个靶向部分上的NPP1催化结构域；编码融合多肽的核酸；包含整合到其中的核酸的载体；用载体转化的宿主细胞；以及包括融合多肽的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】npp1融合蛋白相关申请本申请要求2011年3月11日提交的PCT/US2011/028233的权益，PCT/US2011/028233要求2010年3月12日提交的美国临时申请号61/340,066的权益。将上述申请的全部传授内容通过引用结合在此。专利技术背景胞外核苷酸(ectonucleotide)焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(NPP1/ENPP1/PC-1)是形成同型二聚体的II型跨膜糖蛋白。这种蛋白切割多种底物，包括核苷酸与核苷酸糖的磷酸二酯键以及核苷酸与核苷酸糖的焦磷酸键。NPP1功能是将5’核苷三磷酸酶(triphosphtase)水解为任一相应的单磷酸酯并且还水解多磷酸二腺苷。已经将NPP1基因中的突变与特发性婴儿动脉钙化(IIAC)、胰岛素抗性、低磷酸盐血症性佝偻病、以及脊椎后纵韧带骨化症相关联。IIAC，一种罕见的常染色体隐性且几乎总是致命的紊乱，特征为肌性动脉内弹性膜的钙化以及归因于肌内膜增生的狭窄。全世界范围内已经报告了超过160例IIAC。通常，由于缺血性心肌病，以及阻塞性动脉病的其他并发病(包括肾动脉狭窄)，该疾病的症状最常由早期婴儿表现出，并且该疾病对6月龄婴儿是致命的。在超过十几例报告的IIAC中，在婴儿中还发展了大关节的关节周钙化。Rutsch(如特斯彻)等人，(2003)报告了ENPP1中的突变与其特征为生命早期中的自发性关节周与主动脉钙化以及受累者中的核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶活性的系统性降低的IIAC相关。虽然NPP1蛋白的缺陷已经牵涉到如此严重的疾病(如IIAC)中，但在该领域中没有针对遭受该疾病折磨的患者的可用治疗。因此，存在对用于治疗IIAC、胰岛素抗性、低磷酸盐血症性佝偻病、以及脊椎后纵韧带骨化症有效且安全的组合物、配制品以及药物的迫切需求。专利技术概述本专利技术包括与靶向部分融合的、NPP1的截短结构域(即，NPP1组分)的多种融合蛋白。靶向部分的功能是增强将NPP1融合蛋白靶向到临床或生物学上重要位点(例如，在需要降低钙化的受试者体内的钙化位点)的效力。无意将本专利技术局限于任何具体理论或工作机制，认为NPP1组分功能是通过增强焦磷酸酯(PPi)的形成和/或通过切割焦磷酸酯以产生可溶性磷酸酯(Pi)和/或通过增加腺苷单磷酸(AMP)和/或腺苷的可用性来抑制钙化。在此考虑了该靶向部分可以在任何有用位置处被附接到该NPP1组分的N-端和/或C-端。额外地，在此披露的NPP1融合蛋白还可以包括Fc片段、PEG、多肽接头或其他额外多肽中的一种或多种，以增强该酶的活性、稳定性或靶向性。本专利技术的融合蛋白可以用于治疗受试者体内的多种多样的病症。可以通过给予本专利技术的融合蛋白有益地治疗的任何病症都包括在本专利技术范围内。例如，可以在受试者(如，哺乳动物，例如，人类患者)体内通过减少和/或消除一个或多个钙化结构和/或预防钙化结构形成得以改善的病症的治疗在本专利技术范围内。考虑通过采用本专利技术的融合蛋白治疗病症(例如动脉阻塞)。在一个特别有用的实施例中，待治疗的病症是婴儿型全身性动脉钙化，也称作婴儿型特发性动脉钙化和婴儿型动脉基质钙化。还考虑了病症如胰岛素抗性、低磷酸盐血症性佝偻病以及脊椎后纵韧带骨化症的治疗。可以在任何有用的蛋白表达系统中生产本专利技术的融合蛋白，该表达系统包括但不局限于，细胞培养系(例如，CHO细胞、COS细胞、HEK203)；细菌(例如大肠杆菌(E.coli))以及转基因动物，包括但不局限于，哺乳动物和禽类(例如，鸡、鹌鹑、鸭和火鸡)。药物组合物(或药物配制品)的制造是本领域中所熟知的并且此类药物组合物被考虑为根据本专利技术的融合蛋白使用。一般地，向受试者给予的融合蛋白的剂量将取决于已知因素而改变，这些因素例如接受者的年龄、健康状态与体重，并行治疗的类型、治疗频率，等。通常，活性成分(即，融合蛋白)的剂量可以在约0.0001至约50毫克每公斤体重之间。可由治疗性蛋白的给予领域的医师来确定精确的剂量、给予频率和治疗时间间隔。附图简要说明图1示例了野生型NPP1蛋白的氨基酸序列。加下划线的为胞质和跨膜区域。粗体为潜在的N-糖基化位点。斜体的PSCAKE是包括富含半胱氨酸的区域的可溶性NPP1的起点。图2示例了不具有附接的靶向部分的NPP1蛋白的一个或多个催化结构域的氨基酸序列(“sssNPP1”)。图3示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽，并且靶向部分用粗体表示。图4示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列，该序列包含与sssNPP1的C-端融合的、十个连续天冬氨酸残基的靶向部分。加下划线的为信号肽，并且靶向部分用粗体表示。图5示例了TAGssNPP1融合蛋白的核酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与ssNPP1的N-端融合。图6示例了TAGssNPP1融合蛋白的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与ssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽，并且靶向部分用粗体表示。图7示例了ssNPP1的核酸序列。图8示例了ssNPP1的氨基酸序列。加下划线的为信号肽。图9示例了sNPP1的核酸序列。图10示例了sNPP1的氨基酸序列。加下划线的为信号肽。图11示例了TAGsNPP1的核酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sNPP1的N-端融合。图12示例了TAGsNPP1的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与ssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽，并且靶向部分用粗体表示。图13示例了TAGsNPP1的核酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sNPP1的C-端融合。图14示例了TAGsNPP1的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与该sNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽，并且靶向部分用粗体表示。图15示例了连接肽的氨基酸序列。图16示例了免疫球蛋白Fc区段的氨基酸序列。图17示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列，该序列包含经由肽接头与sssNPP1的N-端融合的、八个连续天冬氨酸残基的靶向部分。Fc区段与靶向部分的N-端融合。加下划线的为信号肽并且靶向部分用粗体表示。斜体为肽接头。图18示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列，该序列包含经由肽接头与sssNPP1的C-端融合的、八个连续天冬氨酸残基的靶向部分。Fc区段与sssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽并且靶向部分用粗体表示。斜体为肽接头。图19是包含TAGsNPP1构建体的表达载体(即，pTT22)的示意性图示。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sNPP1的C-端融合。图20示例了TAGsNPP1的蛋白印迹分析。还原性条件；NR，非还原性条件。图21展示了生产并分离自HEK293细胞的TAGsNPP1的酶活性。图22A-22C示例了在此描述的TAGNPP1融合蛋白构建体的示意图。图23展示了用可溶性sNPP1(WT)、TAGsNPP1(D8与sNPP1C-端融合)、以及sNPP1-Fc处理的人主动脉平滑肌细胞的钙化水平。图24描绘了包含TAGsNPP1构建体的表达载体(即，pTT22)的示意性图示。八个连续天冬氨酸残基(D8)的靶向部分与sNPP1的C-端融合。图25描绘了TAGsNPP1融合蛋白的核酸序列。图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.11 US PCT/US2011/0282331.一种分离的NPP1融合蛋白，选自由以下组成的组：1)由NPP1组分和免疫球蛋白的Fc区组成的NPP1融合蛋白，其中a)所述NPP1组分由SEQIDNO:1的P99到L591的氨基酸序列组成，b)所述Fc区位于所述NPP1组分的C-端，并且c)所述NPP1融合蛋白具有NPP1酶活性，以及2)由NPP1组分、靶向部分和免疫球蛋白的Fc区组成的NPP1融合蛋白，其中a)所述NPP1组分由SEQIDNO:1的P99到L591的氨基酸序列组成，b)所述靶向部分和所述Fc区均位于所述NPP1组分的C-端，其中所述靶向部分由八个连续的天冬氨酸残基组成，并且c)所述NPP1融合蛋白具有NPP1酶活性。2.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中，所述NPP1酶活性是焦磷酸酶活性、磷酸二酯酶活性、或焦磷酸酶和磷酸二酯酶活性。3.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中，所述融合蛋白是一种重组蛋白。4.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中，所述靶向部分被化学连接到所述NPP1的催化结构域上。5.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中，所述NPP1组分由SEQIDNO:1的从P99到D925构成。6.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中所述靶向部分被融合到所述NPP1的催化结构域的C-端上。7.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中所述Fc区被融合到所述NPP1的催化结构域的C-端上。8.如权利要求1所述的NPP1融合蛋白，其中所述Fc区为包含SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·奎因，A·J·哈维，志南·夏，
申请(专利权)人：辛那杰瓦生物制药股份有限公司，
类型：
国别省市：