司帕沙星的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法技术

本发明专利技术公开一种检测司帕沙星的酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有司帕沙星特异性抗体、司帕沙星与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被司帕沙星抗原或特异性抗体的酶标板、司帕沙星标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；司帕沙星特异性抗体为司帕沙星的单克隆抗体。本发明专利技术的司帕沙星酶联免疫试剂盒中主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便、价格低廉；检测时对样品的前处理要求低且处理过程简单，能同时快速用于大批样品的筛查；与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。

【技术实现步骤摘要】
司帕沙星的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法
本专利技术涉及到酶联免疫和食品添加剂残留检测领域。特别是涉及一种用于食品中司帕沙星残留检测的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法。
技术介绍
司帕沙星（Sparfloxacin,SPFX），分子式C19H22F2N4O3；相对分子质量392.41；熔点137-141℃；外观为黄色结晶或结晶性粉末；脂溶性，略溶于冰醋酸、氯仿，微溶于甲醇、乙醇，几乎不溶于乙醚和水；对光、热稳定。SPFX在我国被广泛应用于畜牧、水产养殖、兽医等行业，但其有一定的毒副作用，主要包括胃肠道反应、中枢神经毒性和光毒性等。近年来，由于使用不当导致的动物性食品药物残留和耐药性问题，以及水、土壤污染环境问题已引起大众普遍关注。我国农业部制定的《2013年动物及动物产品兽药残留监控计划》中明确规定了司帕沙星的残留监控指标以及最大残留限量，猪肉和鸡肝等最大残留限量为100µg/kg。目前用于司帕沙星残留检测的方法较多，如高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/质谱联用分析法（LC/MS）、气相色谱/质谱联用分析法（GC/MS）、荧光探针法、薄层色谱扫描法、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。但常用的理化分析方法需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员等条件，而且操作过程复杂，检测时间较长，故限制了其应用范围，难以在生产实际中推广应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题：克服
技术介绍
中的问题，提供一种特异、灵敏、快速、简便的快速检测司帕沙星的酶联免疫试剂盒；还提供了司帕沙星的酶联免疫试剂盒的组建方法和检测方法。本专利技术的技术方案：一种检测司帕沙星的酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有司帕沙星特异性抗体、司帕沙星与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被司帕沙星抗原或特异性抗体的酶标板、司帕沙星标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；所述司帕沙星特异性抗体为司帕沙星的单克隆抗体。所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔铜蓝蛋白；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶或羊抗鼠IgG抗体。所述的洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的盐酸。所述的底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述试剂盒还包括浓缩样品稀释液，浓缩样品稀释液为含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。所述司帕沙星与载体蛋白的偶联物是由以下方法得到的：（1）称取3mg的司帕沙星、3mg的N-羟基琥珀酰亚胺和3mg的N,N-二环己基碳二亚胺溶于1mLDMF溶剂中，室温下反应3小时，得到A液；（2）称取5.1mg的牛血清白蛋白溶于2mL、0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液中，得到B液；（3）在室温磁力搅拌下，将A液逐滴加入B液中，4℃反应过夜；（4）反应液用PBS透析3天，换液3次/天；透析完成后，4000r/min离心5min，取上清液，得到司帕沙星与载体蛋白的偶联物，贮藏于-20℃，备用。所述司帕沙星的单克隆抗体是由以下方法制备的：（1）免疫以SPFX-BSA为免疫原，取SPF级6-7周龄BALB/c雌性小鼠进行免疫，每只200µL，初次每只免疫剂量为30µg，其后3次的免疫剂量均为50µg/只；采用背部皮下4-6点注射，初免用SPFX-BSA的PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫；20d后用SPFX-BSA的PBS溶液与等体积FIA混合乳化后加强免疫，免疫间隔3周，第五次免疫后进行细胞融合；（2）细胞融合将NS0骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例在PEG的作用下融合，然后置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半量换液，8天后检测细胞上清，筛选阳性孔；（3）杂交瘤细胞的筛选细胞融合后，取各孔细胞上清，用PBS稀释5倍后用间接ELISA测定效价，用小鼠血清作阳性对照，挑选阳性孔，使用间接竞争ELISA法测定敏感性，选取效价高于或等于对照孔的细胞孔，转入24孔细胞板中进行扩大培养，待细胞长至底部一半以上时，再次测定效价和敏感性，进行敏感性测定，选取敏感性最高的孔进行亚克隆；（4）单克隆抗体的制备将BALB/C小腹腔内接种液体石蜡，每只小鼠接种量300～500µL，将筛选出的单克隆细胞株转入细胞培养瓶中进行扩大培养，待细胞保持对数增长的时候用无血清培养基稀释，将0.5×107～1.0×107个克隆化的阳性细胞注入小鼠体内，观察小鼠腹水生产情况，当小鼠腹部出现明显肿大且腹部皮肤紧绷时即可采集腹水，然后3000r/min离心5min，吸取上清除去细胞及杂质，得到司帕沙星的单克隆抗体。一种检测司帕沙星酶联免疫试剂盒的组建方法，包括盒体内的司帕沙星单克隆抗体的制备；司帕沙星与载体蛋白偶联物的制备；所述司帕沙星与载体蛋白偶联物的制备方法如下：（1）称取2mg的司帕沙星、2mg的N-羟基琥珀酰亚胺和2mg的N,N-二环己基碳二亚胺溶于1mLDMF溶剂中，室温下反应3小时，得到A液；（2）称取5.1mg的牛血清白蛋白溶于2mL、0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液中，得到B液；（3）在室温磁力搅拌下，将A液逐滴加入B液中，4℃反应过夜；（4）反应液用PBS透析3天，换液3次/天；透析完成后，4000r/min离心5min，取上清液，得到司帕沙星与载体蛋白的偶联物，贮藏于-20℃，备用。一种检测样品中司帕沙星含量的方法，包括步骤：（1）样品前处理；（2）用所述的试剂盒进行检测，向包被有司帕沙星抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入司帕沙星单克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测吸光度值；（3）分析检测结果。本专利技术试剂盒的检测原理：本专利技术采用DCC法合成司帕沙星人工抗原，制备的司帕沙星抗体能与司帕沙星发生特异性结合，从而达到检测食品中司帕沙星残留的目的。将司帕沙星抗原吸附于固相载体上，加入样本或司帕沙星标准品溶液，并加入抗司帕沙星的司帕沙星单克隆抗体工作液，待测样品中司帕沙星与固相载体上包被的司帕沙星抗原竞争司帕沙星抗体，再加入酶标记抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品吸光度值，该值与样品中司帕沙星的量呈负相关，通过标准曲线比较即可得出司帕沙星的浓度范围。本专利技术的积极有益效果：（1）本专利技术的司帕沙星酶联免疫试剂盒中主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便、价格低廉；与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。（2）本专利技术的试剂盒采用间接竞争酶联免疫测定法定性或定量样品中司帕沙星的含量，对样品的前处理要求低且处理过程简单，能同时快速用于大批样品的筛查。（3）本专利技术的试剂盒检测操作步骤较少，节省检测时间，降低操作误差。（4）本专利技术基于抗原抗体免疫反应的免疫学快速检测技术进行检测，为司帕沙星残留检测提供一个新途径，该方法稳定性好，可在违禁食品成分司帕沙星的检测中发挥重要作用。附图说明图1司帕沙星标准品的抑制浓度曲线（ug/L）。该图说明标抗司帕沙星抗体进行标准品抑制的线性关系良好(R2=0.9827)，其半数抑制浓度为31ug/L。具体实施方式为进一步理解本专利技术提供了以下实施例，但并不表示对本
技术实现思路
的任何限制。如没有特别说明，其中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测司帕沙星的酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征在于：盒体内设有司帕沙星特异性抗体、司帕沙星与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被司帕沙星抗原或特异性抗体的酶标板、司帕沙星标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；所述司帕沙星特异性抗体为司帕沙星的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测司帕沙星的酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征在于：盒体内设有司帕沙星特异性抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体、包被司帕沙星人工合成抗原的酶标板、司帕沙星标准品溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；所述司帕沙星特异性抗体为司帕沙星的单克隆抗体；所述底物显色液由显色剂A过氧化氢和显色剂B邻苯二胺组成；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液，终止液为2mol/L的盐酸；所述试剂盒还包括浓缩样品稀释液，浓缩样品稀释液为含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述的司帕沙星人工合成抗原为司帕沙星与载体蛋白的偶联物，所述司帕沙星与载体蛋白的偶联物是由以下方法得到的：（1）称取3mg的司帕沙星、3mg的N-羟基琥珀酰亚胺和3mg的N,N-二环己基碳二亚胺溶于1mLDMF溶剂中，室温下反应3小时，得到A液；（2）称取5.1mg的牛血清白蛋白溶于2mL、0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液中，得到B液；（3）在室温磁力搅拌下，将A液逐滴加入B液中，4℃反应过夜；（4）反应液用PBS透析3天，换液3次/天；透析完成后，4000r/min离心5min，取上清液，得到司帕沙星与载体蛋白的偶联物，贮藏于-20℃，备用；所述司帕沙星的单克隆抗体是由以下方法制备的：（1）免疫以SPFX-BSA为免疫原，取SPF级6-7周龄BALB/c雌性小鼠进行免疫，每只200µL，初次每只免疫剂量为30µg，其后3次的免疫剂量均为50µg/只；采用背部皮下4-6点注射，初免用SPFX-BSA的PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫；20d后用SPFX-BSA的PBS溶液与等体积FIA混合乳化后加强免疫，免疫间隔3周，第五次免疫后进行细胞融合；（2）细胞融合将NS0骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例在PEG的作用下融合，然后置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半量换液，8天后检测细胞上清，筛选阳性孔；（3）杂交瘤细胞的筛选细胞融合后，取各孔细胞上清，用PBS稀释5倍后用间接ELISA测定效价，用小鼠血清作阳性对照...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓瑞广，张改平，胡骁飞，柴书军，杨继飞，贾国超，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：