一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种两步法快速检测过敏性疾病变应原诊断试剂盒及其制备方法和使用方法。该试剂盒使用时，首先将待检测血清样本和过氧化氢酶标记的变应原等体积混合后，室温孵育5-15分钟后，再将混合后的样品加到胶体金试纸条的样品孔中，5-15分钟后读结果。该试纸条包括样品孔、胶体金垫、膜条和吸水垫。胶体金通过链霉素蛋白和标记生物素的羊抗过氧化氢酶抗体偶联，在膜条上包被有鼠抗人IgE单克隆抗体，最终形成胶体金-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体-过氧化氢酶-变应原-特异性人IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物，质控带包被有鼠抗羊IgG抗体。该试剂盒检测总时间为10～30分钟。该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作变应原特异性IgE检测试剂。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种两步法快速检测过敏性疾病变应原诊断试剂盒及其制备方法和使用方法。该试剂盒使用时，首先将待检测血清样本和过氧化氢酶标记的变应原等体积混合后，室温孵育5-15分钟后，再将混合后的样品加到胶体金试纸条的样品孔中，5-15分钟后读结果。该试纸条包括样品孔、胶体金垫、膜条和吸水垫。胶体金通过链霉素蛋白和标记生物素的羊抗过氧化氢酶抗体偶联，在膜条上包被有鼠抗人IgE单克隆抗体，最终形成胶体金-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体-过氧化氢酶-变应原-特异性人IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物，质控带包被有鼠抗羊IgG抗体。该试剂盒检测总时间为10～30分钟。该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作变应原特异性IgE检测试剂。【专利说明】
本专利技术涉及一种过敏性疾病变应原诊断试剂盒(胶体金法)及其制备方法，以及这种试剂盒的使用方法。
技术介绍
变应性疾病(又称过敏性疾病)包括特应性皮炎、食物过敏、变应性鼻炎和过敏性哮喘等，其发病率日益增高，且病情逐趋复杂化。WHO已将变应性疾病列为21世纪重点研究和防治的疾病。近年，随着免疫组化、分子生物学技术和临床新技术，如纤维支气管镜的开展，已对此病有了共识，即其属于过敏性炎症，在炎症区有大量炎症细胞(包括嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞等)浸润。此病的发病主要涉及变应原、抗体、细胞、受体和介质5个环节。当过敏原激发后，在15?20分钟所发生的速发相反应主要与肥大细胞有关，而在激发后4?24小时所发生的迟发反应则被认为有嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞参与。这两个时相的反应均依赖于T淋巴细胞，特别是辅助T细胞(TH)中的一个亚型TH2。变应原是引起过敏性炎症的原因，因此若能发现致敏变应原种类，则对防治过敏性疾病有重要意义。过敏性疾病大多为I型变态反应性疾病，是临床多发病症,具有季节性和区域性高发的特点。多因吸入尘螨、植物花粉、毛屑等变应原或因呼吸道感染病原微生物感染而引起。呼吸道过敏反应最常见的典型疾病是变应性鼻炎和支气管哮喘。支气管哮喘在许多国家其患病率和死亡率有增加的趋势，如美国、英国、澳大利亚、新西兰等国近一年内的哮喘发生率在10-30%之间。2003年中国城区儿童哮喘患病率调查结果显示:0-15岁儿童哮喘现患病率为0.12?3.34%，全国平均为1.54% ;累计患病率为1.97%，与10年前(1988?1990抽样调查，0.11?2.03%)相比明显增加。70%患儿首次喘息发作在3岁内；以呼吸道感染和过敏为诱因导致发作者占94.62%，文章分析认为其中部分可能为过敏性鼻炎症状。该调查显示，哮喘给患儿、患儿家庭和社会经济造成了严重的影响。病人及家长医疗需求迫切。关于哮喘的诱发因素，有大量的研究表明，过敏是致喘的重要因素，其中尘螨、室尘、花粉较为重要。特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是儿童期最常见的一种慢性皮肤炎症,全世界儿童5%?20%患有特应性皮炎，其中60%进入青春期后仍有特应性皮炎表现。将近80%患者有发生呼吸道变态反应的危险，包括变应性鼻炎和哮喘。吸入性变应原，包括室内尘螨和动物皮毛，是特应性皮炎的潜在诱因。在一个双盲对照研究中，Tan等发现尘螨避免可改善特应性皮炎。由此可见，进行皮肤点刺试验或特异性血清IgE测定对确定特应性皮炎患者是否有气传变应原变态反应及采取合适的变应原避免措施很有用。慢性荨麻疹、湿疹是常见的复发性、过敏性皮肤病，病因复杂，往往无法根治，易复发；前者为机体接触变应原后发生I型或III型变态反应及非变态反应两条途径致病，后者是由内外激发因子引起的一种迟发型变态反应。其中60?80%发病与特异性变应原有关，一次变应原的作用是发病关键，若能及时检测出患者的变应原，对预防和治疗这类疾病极有意义。过敏性疾病变应原的诊断方法分为体内试验和体外试验，体内试验有皮内试验和点刺试验两种方法。体外试验的方法主要有免疫印迹、酶联免疫分析发、放射性免疫分析法和荧光免疫分析。皮肤试验的原理是使微量无害的变应原进入皮肤，与皮下肥大细胞表面的特异性IgE抗体结合，经过一系列的酶激活，使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等多种化学介质，从而使局部血管扩张、通透性增加，出现丘疹和红晕反应。临床上根据反应情况，对I型变态反应性疾病的病因进行诊断。其试验的方法有多种，较常用的有皮内试验和皮肤点刺试验(SPT)。皮内试验变应原液是进入真皮，而SPT变应原液仅进入表皮。过敏性疾病变应原的诊断，是一个系统性排除筛查试验，往往为了确诊患者的过敏原，需要进行几十种疑是变应原的筛查，初次筛查利用体内皮肤试验，会给患者带来很大不必要的痛苦。在过敏性疾病变应原诊断的流程中，先通过体外诊断试剂盒初筛确诊具体变应原，然后通过体内试验确认过敏变应原。所以过敏性疾病变应原体内诊断和体外诊断的方法是相辅相成，体外诊断避免了用体内试验带来的不必要痛苦和危害。过敏性疾病变应原体外诊断的主要原理为变应原与患者血清中的特异性IgE结合，然后再与酶标、放射性同位素标记、荧光素标记的二抗结合，再与底物反应，病人血清中的特异性IgE与底物反应的强度成正比。现上市的过敏性疾病变应原体外诊断试剂盒为免疫印迹和酶联免疫分析为原理的试剂盒，操作时间长(150min?240min)，操作步骤复杂(包括孵育，洗脱等步骤)，配套设备昂贵(10?30万元)，操作需要经过专业培训的技术员来操作。严重的影响了变应原体外检测方法的普及，目前国内大多三甲医院才拥有变应原体外检测的能力，我国大多基层医院和部队野外医院均不能开展变应原体外诊断的方法。本专利技术提供的过敏原体外诊断试剂盒反应时间快(10?30min)，操作简单，无配套设备，灵敏度高，适合我们不同级别医院的使用。胶体金免疫分析法相比其它免疫分析法快速(10?30min)、简便，不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行，廉价，可立刻拿到结果，不必等待，稳定性好，可长期保存。胶体金免疫分析方法是21世纪生化检验POCT (point of care Testing即床边检验)发展方向之一。胶体金免疫分析方法已经广泛用于传染病、肿瘤疾病的早期诊断和预防，但结合过敏原的特殊性质，变应原提取液是一个复合物，含有致敏蛋白、非致敏蛋白、色素等分子，传统的胶体金分析方法用于变应原检测，灵敏度低。本专利技术采用两步法胶体金分析方法，将鼠抗人IgE代替变应原包被在胶体金膜上，将过氧化氢酶标记的变应原和血清样本在加样前孵育，血清样本中的slgE充分和过氧化氢酶标记的变应原结合反应，然后再加到样品孔中，结合了 slgE的过氧化氢酶标记的变应原和胶体金上的羊抗过氧化氢酶多克隆抗体结合，再流动到膜上和鼠抗人IgE反应结合形成胶体金-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体-过氧化氢酶-变应原-特异性人IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物后显色。本专利技术提供的变应原特异性抗体IgE快速诊断试剂盒，通过技术上的改进克服了传统胶体金法在变应原使用上的技术瓶颈，诊断快速，操作简单，能够广泛的应用医疗机构。
技术实现思路
本专利技术提供了一种变应原特异性IgE抗体快速检测试剂盒，该试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒，包括过氧化氢酶标记的变应原和胶体金诊断试纸条；其中，所述变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种；所述的胶体金诊断试纸条包括样品孔、金标垫、膜条和吸水垫。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白彩明，裴潇竹，姜敏，马博晨，汤承祁，牛占坡，
申请(专利权)人：北京新华联协和药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：