本发明专利技术公开了一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法。该方法涉及一种经过密码子优化的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt?Cry35Ba2的基因，具体如序列表中序列1所示。本发明专利技术所提供的苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：1）将含有序列1的第109-1269位或整个序列1所示DNA片段的重组载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；2）培养所述重组大肠杆菌，进行诱导表达，收集并裂解菌体，获得苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白Bt?Cry35Ba2（序列2）。在大肠杆菌中，本发明专利技术所提供的经过密码子优化的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt?Cry35Ba2基因（N-Cry35Ba2基因）表达所得蛋白并未因密码子优化而影响其蛋白活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法，特别涉及。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌，在其芽孢的形成过程中，会形成具有杀虫活性的晶体蛋白(Cry蛋白)。该蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种害虫具有较高的毒性，是应用最为广泛的毒蛋白。由于此特性，编码Cry蛋白的基因被生物学者认作是转基因作物的热门备选基因，并已有多个转基因作物品种转入该基因并商品化，在全球范围内广泛种植。Bt菌系含有大量不同的杀虫晶体蛋白编码基因，至今已有近180个不同的Bt杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序，Bt Cry35Ba2就是其中一种，主要针对危害玉米等作物根部的鞘翅目幼虫具有毒性。转基因作物的种植满足了人类对粮食产量、经济效益需求。同时，也存在着环境安全风险，外源基因导入的随机性和不确定性，基因表达对作物的生理生化作用的改变，对生态环境构成的威胁等等都难以预测。人们对转基因作物的安全性存在担忧，而消除这一担忧的有效途径就是对转基因作物所表达的外源蛋白进行安全性评价。因此，获取各种Bt杀虫晶体蛋白基因所表达的外源蛋白，对进行安全性评价意义重大，为后续的检验方法建立、检测标准的实施提供基础，从而可以有效防止安全隐患的发生，避免转基因作物对生态环境的破坏，充分发挥转基因技术在农业生产上的巨大应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种经过密码子优化的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白BtCry35Ba2的基因。所述经过密码子优化的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry35Ba2的基因，是在不改变苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry35Ba2氨基酸序列(GenBank:AY536894.1的第1-387位氨基酸)的前提下，将其野生型编码基因(GenBank:AY536894.1的第1-1161位)的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子后所得的基因。将优化后的基因命名为N-Cry35Ba2，具体可为如下a) _c)中任一 DNA分子:a)序列表中序列I的第109-1269位核苷酸所示的DNA分子；b)序列表中序列I所示的DNA分子；c)与a)或b)所限定的DNA分子至少具有98%的同一性，且编码序列2或序列2的第37-423位氨基酸所示蛋白质的DNA分子。其中，序列I共由1296个核苷酸组成，其中第109-1269位核苷酸为将GenBank:AY536894.1的第 1-1161位的密码子替换为大肠杆菌偏好密码子后所得的基因序列。序列I编码序列表中序列2所示的蛋白质，其中序列I的第109-1269位核苷酸编码序列2的第37-423位氨基酸。序列2共由431个氨基酸组成。含有所述DNA分子(N_Cry35Ba2基因)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因(GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。在本专利技术中，所述重组表达载体中启动所述DNA分子(N_Cry35Ba2基因)转录的启动子具体为17启动子。所述重组表达载体具体为将所述DNA分子(N_Cry35Ba2基因)插入到质粒pET28a的多克隆位点处得到的重组质粒。在本专利技术的一个实施例中，所述多克隆位点为EcoR I和Xho I。更加具体的，所述重组表达载体的(pET28a-35Ba2)的核苷酸序列如序列表中序列3所示。其中，序列3共由6502个核苷酸组成，第137-1432位核苷酸为序列I的反向互补序列。 由所述DNA分子(N_Cry35Ba2基因)转录所得的RNA分子也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的再一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术所提供的蛋白质，具有苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry35Ba2活性，具体为序列表中序列2所不的蛋白质。所述蛋白质的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述RNA分子，或所述蛋白质在制备具有杀虫活性的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。在所述应用中，所述虫为玉米根虫(如三龄初期玉米根虫)；所述产品可为试剂盒。所述DNA分子在提高大肠杆菌中苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白Bt Cry35Ba2表达量中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白BtCry35Ba2具体为序列表中序列2所示蛋白质。本专利技术的还一个目的是提供。本专利技术所提供的苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白Bt Cry35Ba2的制备方法，具体包括如下步骤:I)将表达所述DNA分子的所述重组载体(如重组表达载体pET28a_35Ba2)导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；2)培养所述重组大肠杆菌，进行诱导表达，收集并裂解菌体，获得苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白Bt Cry35Ba2 ；所述苏z 金芽抱杆菌晶体融合蛋白Bt Cry35Ba2具体为序列表中序列2所不蛋白质。在上述方法中，步骤I)中的所述表达载体可为能够表达序列表中序列I所示DNA分子的其他重组原核表达载体。在上述方法中，步骤2)中，所述诱导表达具体为:向培养有所述重组大肠杆菌的培养液中加入IPTG至终浓度为lmM，22°C震摇培养6小时。所述培养有所述重组大肠杆菌的培养液的0D600值为0.6-0.8之间。所述震荡培养的转速为180rpm，旋转半径为1.5厘米。在上述方法中，步骤2 )中，在所述“收集并裂解菌体”之后，还包括离心后收集并溶解包涵体的步骤。在ImM IPTG，22°C诱导6小时的条件下，所述苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白BtCry35Ba2主要表达于包涵体中。本专利技术应用基因工程方法在国内首次合成苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白BtCry35Ba2基因(N-Cry35Ba2基·因)。实验证明，在大肠杆菌中，本专利技术所提供的经过密码子优化的苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白Bt Cry35Ba2基因(N_Cry35Ba2基因)表达所得蛋白并未因密码子优化而影响其蛋白活性。本专利技术为进一步探讨苏云金芽孢杆菌晶体蛋白BtCry35Ba2的检测方法、生理功能及其作用机制、降解机制打下了基础。附图说明图1为重组质粒用EcoR I和Xho I进行双酶切后DNA分子电泳图。其中，泳道Marker为购买的DNA分子量标准IOKbp到IOOObp条带(天根生物科技(北京)有限公司，产品目录号MDlOO-1Kb Ladder)。泳道I为重组表达载体pET28a_35Ba2用EcoR I和Xho I进行双酶切后条带。图2为苏云金芽孢杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA分子，为如下a）?c）中任一：a）序列表中序列1的第109?1269位核苷酸所示的DNA分子；b）序列表中序列1所示的DNA分子；c）与a）或b）所限定的DNA分子至少具有98%的同一性，且编码序列2或序列2的第37?423位氨基酸所示蛋白质的DNA分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，曹振，谭桂玉，张亮，张威，郭素琴，张瑞，何丽珊，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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