马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒快速联检试纸条制造技术

发明专利技术公开一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成；纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗MDV和抗REV的抗体检测印迹；所述抗MDV和抗REV的抗体为抗MDV和抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗REV的混合多克隆抗体或单克隆抗体。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便，检测快速，结果直观，适用于MDV和REV病毒的现场快速联合检测，亦可用于两种病毒的单独感染或混合感染的鉴别诊断。该试纸条应用范围广，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测马立克氏病和禽网状内皮组织增生病的器具，特别是涉及一种一步法快速检测马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的联检胶体金试纸条。
技术介绍
马立克氏病(Marek，s disease, MD)是由马立克氏病病毒(Marek，s diseasevirus, MDV)引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋巴组织增生性肿瘤病，主要危害鸡，鹌鹑、山鸡也有发病。该病可引起内脏器官、肌肉和外周神经的淋巴细胞瘤的神经肿大。临床上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状，最常见的病变是神经损害和多种实质脏器的淋巴肿瘤，以肝脏、脾脏肿瘤最为多见，因神经损害导致的不对称性进行性麻痹，最终可引起单个或多个肢体的完全性麻痹。MDV属于疱疹病毒科，有三种不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含有特异性抗原。I型MDV感染能引起肿瘤，II型和III型MDV毒株无致病性，可用于疫苗株。禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其他禽类以网状细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生病、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。REV属于反转录病毒科，是另外一种可引起禽类肿瘤的病毒，虽然不同毒株的致病力不太相同，但都具有相似的抗原性，即属于同一血清型。RE是禽类最重要的免疫抑制性和肿瘤性疾病之一。作为能诱发禽类肿瘤及免疫抑制疾病最重要的两种病毒，MDV和REV已在世界范围内对养禽业造成了巨大损失。近年来，免疫抑制性病毒共感染的报道越来越多，不同临床症状的鸡群中MDV和REV共感染的现象已经相当普遍，在疑似MD肿瘤的病例中，至少有三分之一的病例可以同时分离到MDV和REV。MDV和REV单独感染鸡均可导致肿瘤病变，二者协同作用会导致更加明显的肿瘤病变。尽管MDV和REV诱导产生淋巴瘤的机制不同，但肿瘤在组织脏器的分布却非常相似。此外，国外已有多项研究证实，MDV和REV在CEF细胞共培养数代后会发生体外重组。更加令人担忧的是，我国学者已从发病鸡群中分离到含有REV病毒基因组片段的MDV自然重组毒株，这种重组增加了 MDV在感染鸡群中的水平传播能力。由于临床症状和剖检病变非常相似，再加上MDV和REV的共感染普遍存在，增加了这两种家禽病毒性肿瘤病的临床诊断尤其是鉴别诊断的难度，一些传统的诊断方法很难将其准确、快速地区分开来，给临床诊断及防制工作带来了困难。目前，临床上最常用鉴别诊断方法是病毒分离培养、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离鉴定不但对临床诊断很有价值，对流行病学及病原学研究亦至关重要，但该方法检测周期长，约需I 2个月，同时细胞培养的操作要求高，局限性较大。血清学方法如ELISA等主要用于检测羽毛囊上皮、溶细胞感染的淋巴细胞组织及细胞培养物等样品。此类方法检测成本相对较高，并且由于部分病例中的REV感染呈“一过性”特征、病毒血症时间较短，病毒含量低，导致检出率较低。分子生物学方法如PCR、荧光定量PCR和LAMP等技术主要是用于病毒核酸的检测，这些技术虽然能比较准确的鉴别诊断MDV和REV，但操作复杂，需要特定的试剂及昂贵的仪器设备，操作要求高，难以适合生产一线或疫病现场快速鉴别诊断的需要。因此，急需研究一种快速鉴别检测MDV和REV的新技术，这对于MD和RE的有效防控具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是:提供一种简便、准确、结果直观、肉眼可判的一步法快速检测马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的试纸条，该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、成本低廉，并且可以同时检测两种病毒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是: 一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及分别含有MDV抗体和REV抗体的检测印迹，所述MDV抗体和REV抗体分别为抗MDV和抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成；所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3 0.7cm处印制有样品标记线，检测印迹与对照印迹的排列组合为“ I I I ”、“/ / /”、“ + + + ”、 “丁丁丁”、“ |_ p’中的一种。所述胶体金标记的抗MDV和抗REV的单克隆抗体是通过以下方法制备的: 将筛选获得的抗MDV和抗REV的单克隆细胞株分别进行扩大培养，用PBS洗涤2遍后1000 r/min离心10 min，收集细胞，以每只I X IO6 2X IO6个细胞的量分别对经产母鼠进行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，分别获得抗MDV和抗REV的单克隆抗体腹水； 用柠檬酸钠还原法制备金溶胶:在50 100 mL沸腾的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5 2 % (wt)柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15 20 nm的胶体金溶胶；以0.lmol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶胶的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印迹比将所述抗MDV的单克隆抗体腹水或抗REV的单克隆抗体腹水分别加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加20 % (wt)的PEG-10000至PEG-10000的终浓度为0.05 %(wt), 4°C下、1500 3000 r/min离心20 min,除去未结合的胶体金颗粒,在4°C、15000 r/min条件下离心I h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分别分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗MDV单抗和抗REV单抗。所述抗MDV和抗REV的单克隆抗体细胞株是由以下方法分别制备的: 分别用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的重组质粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重组质粒PET-28a-gp90，转化大肠杆菌BL-21并挑选阳性克隆菌株；摇菌培养后用IPTG诱导蛋白表达，菌液上清经超声波裂解后过镍柱纯化，分别得到纯化的MDV gB表达蛋白和REV gp90表达蛋白； 将纯化的gB表达蛋白和gp90表达蛋白分别以20 30 u g/只的剂量用福氏佐剂乳化，制备免疫原免疫6周龄Balb/c系小鼠两组,每组免疫三次,每次间隔15 30 d ;最后一次加强免疫后3 4 d，分别将两组免疫鼠眼球放血，拉颈本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于：所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及标记的MDV抗体、REV抗体的检测印迹，所述MDV抗体、REV抗体为抗MDV、抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于:所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及标记的MDV抗体、REV抗体的检测印迹，所述MDV抗体、REV抗体为抗MDV、抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成。5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜 ，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3 0.7 cm处印制有样品标记线。7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:检测印迹与对照印迹的排列为“I II ”、“/ / /，，、“十十+，，、“丄丄丄”、“丁丁 丁，，、“ 1-1-卜”中的一种。8.根据权利要求1 7任一项所述的试纸条，其特征在于:所述胶体金标记的抗MDV和抗REV的单克隆抗体是通过以下方法制备的: 将筛选获得的抗MDV和抗REV的单克隆细胞株分别进行扩大培养，用PBS洗涤2遍后1000 r/min离心10 min，收集细胞，以每只I X IO6 2X IO6个的细胞量分别对经产母鼠进行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，分别获得抗MDV和抗REV的单克隆抗体腹水； 用柠檬酸钠还原法制备金溶胶:在50 100 mL沸腾的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5 2 %(wt)柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15 20 nm的胶体金溶胶；以0.lmol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶胶的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印迹比将抗MDV和抗REV的单克隆抗体腹水分别加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加 20 % (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的终浓度为 0.05 % (w...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊，滕蔓，张改平，崔治中，邓瑞广，江国托，柴书军，赵鹏，邢广旭，李学伍，乔松林，程娜，郝慧芳，李青梅，金前跃，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：