一种活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗rHVT-HA，其中，该HVT重组有禽流感病毒的HA基因，该HA基因能表达HA蛋白。本发明专利技术的活疫苗能在体内快速产生HI抗体，较传统的灭活疫苗具有更有效地预防禽流感的效果，且能对马立克氏病毒的感染产生良好的保护作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品领域，具体地涉及一种治疗禽流感的活疫苗、制备方法和应用。
技术介绍
H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)可引起鸡的呼吸道疾病和产蛋下降，在混合感染或继发感染其它病原的情况下有较高的发病率和死亡率，给我国养禽业造成严重的经济损失。其基因组由8段单链的反义RNA构成，编码10种蛋白质，其中8种蛋白质是结构蛋白，包括HA和NA，其他两种蛋白是非结构蛋白。一般认为HA是其主要的抗原基因，其可以在禽类中引发保护性抗体。然而，H9亚型AIV的变异速度较快，现有疫苗株不能有效保护流行株，并且，现有的疫苗多是灭活疫苗，其可以刺激机体产生体液免疫，但却不能产生粘膜免疫和细胞免疫，免疫期不长，此外，灭活疫苗的生产成本高，生产过程中可能造成病毒对环境的污染。因此需要筛选流行株来制备新型疫苗以解决现有存在的问题。马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的鸡淋巴组织增生性肿瘤疾病。马立克氏病是可以通过疫苗控制的肿瘤性疾病，该病在我国许多地区时有发生，即使免疫鸡群也会有发病的情况，MDV感染会诱发产生免疫抑制现象，还会继发或混合感染，使MD的疫情更加严重，引起更高的发病率和死亡率，给养禽业造成了巨大的经济损失。
技术实现思路
本专利技术利用火鸡疱疹病毒(HVT)，即马立克氏病病毒血清型-3作
为活病毒载体表达禽流感病毒HA基因，以克服现有禽流感灭活疫苗的上述缺陷，本专利技术通过构建重组火鸡疱疹病毒可有效解决上述问题。本专利技术的第一方面在于提供一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗rHVT-HA，其中，所述HVT重组有禽流感病毒的HA基因，所述HA基因能表达HA蛋白，所述禽流感病毒的HA基因重组到HVT基因组中非必需区US2基因157-167位氨基酸之间。该禽流感病毒HA基因可以自禽流感病毒任何亚型或任何毒株获得。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的活疫苗rHVT-HA中，所述HVT为FC126株、PB-THV1株、H-2株、YT-7株、WTHV-1株和HPRS-26株。火鸡疱疹病毒是疱疹病毒科(Herpesviridae family)和α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae subfamily)中的双链线性DNA病毒。HVT在家养火鸡中是普遍存在的且是非致癌的，并且它被分类为马立克氏病病毒血清型3。已经广泛地使用HVT对鸡进行接种以在鸡中预防马立克氏病。只要它对鸡是非致病的，本专利技术中便可以使用任何HVT。例如，下列HVT毒株，FC126、PB-THV1、H-2、YT-7、WTHV-1和HPRS-26适用于主链病毒。这些之中，优选地，FC126毒株有利地适用于本专利技术。HVT病毒FC126株、PB-THV1株、H-2株、YT-7株、WTHV-1株和HPRS-26株均可从商业途径购得。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的所述的活疫苗rHVT-HA中，所述HA基因包括禽流感病毒H9亚型的HA基因。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的所述的活疫苗rHVT-HA中，所述HA基因包括H9亚型禽流感病毒HL株、SZ株及A155-1-2014株的HA基因。作为本专利技术的一种最优选实施方式，本专利技术的所述的活疫苗rHVT-HA中，所述HA基因序列包括编码SEO.No.4氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，所述HA基因自H9亚型禽流感病毒获得。优选地，所述HA基因自H9亚型禽流感病毒HL株、SZ株及A155-1-2014株获得。优选地，所述A155-1-2014株的HA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。优选地，所述H9亚型禽流感病毒A155-1-2014株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本专利技术中，将HA基因插入到HVT基因组中，优选地，将HA基因插入到HVT基因组中病毒生长非必需的区域，其在这里称为非必需区。换言之，非必需区可定义为这样的区域，其中外来基因的修饰或插入不会阻止病毒在体外或在体内成功复制。优选地，HVT基因组中非必需区为UL43、US2、UL44和UL46之间的区域。优选地，HVT基因组中非必需区为US2。优选地，HA基因插入到HVT基因组中非必需区US2的位点为US2基因157-167位氨基酸之间。HA基因是禽流感病毒的保护性抗原基因，而主链HVT是马立克氏病活体疫苗，所以本专利技术中含有HA基因的重组HVT可以用作针对AI和马立克氏病的二价疫苗，或者用作针对AI的单价疫苗。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的所述的活疫苗rHVT-HA中还包括载体，佐剂。该疫苗还可以包括禽细胞、培养基成分、缓冲液如盐酸盐缓冲液和HEPES缓冲液和/或佐剂诸如细胞因子和CpG寡脱氧核苷酸。只要不是药理学上有害的，该疫苗还可包含有任何成分诸如防腐剂。另外，本专利技术的疫苗可以与任何重组的或非重组的病毒(诸如MDV血清型1或血清型2疫苗毒株)在混合物中使用。本专利技术的第二方面在于提供一种禽流感HA基因，其核苷酸序列如SEO.No.3所示。本专利技术的第三方面在于提供一种禽流感HA蛋白，其氨基酸序列如SEO.No.4所示。本专利技术的第四方面在于提供一种制备所述的活疫苗rHVT-HA的方法，所述方法包括：1)提供火鸡疱疹病毒HVT；2)克隆所述禽流感病毒的HA基因；3)重组所述禽流感病毒的HA基因到所述火鸡疱疹病毒HVT基因组中；4)培养增殖所述重组HVT-HA病毒；以及5)将所述增殖重组病毒与载体混合。任何已知方法可适用于制备本专利技术中的重组二价疫苗。例如，可以将重组HVT接种到允许培养细胞(诸如CEF细胞)中，并培养至合适的滴度。然而，通过胰蛋白酶处理从转瓶中取出的细胞，并通过离心收集。然后将所沉淀的细胞在含有二甲基亚砜的培养基中混悬，缓慢地冷冻，然后贮存在液氮中。或者，可以通过在含有稳定剂(诸如蔗糖和牛血清蛋白)的稀释剂中破坏细胞来从感染的细胞中释放重组HVT。这些所释放的HVT成为无细胞的HVT。可以冻干无细胞的HVT，并于4℃贮存。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术制备所述的活疫苗rHVT-HA的方法中，所述禽流感病毒的HA基因序列包括编码SEO.No.4氨基酸序列的核苷酸序列；重组所述禽流感病毒的HA基因到所述火鸡疱疹病毒HVT US2基因157-167位氨基酸之间。具体地，本专利技术制备的重组活载体HVT疫苗是通过下列方式来实现的：1.扩增H9N2禽流感病毒的HA基因，将其克隆到真核表达载体pcDNA中；2.将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含lacZ和HA基因表达盒克隆入马立克氏病病毒US2基因中，构建马立克氏病病毒的转移载体；3.通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中，通过蓝斑筛选获得重组病毒；4.PCR方法鉴定该基因组中是否含有完整的HA基因，并通过免疫酶反应和Western-blot证实重组病毒能否表达禽流感HA蛋白，并鉴定其是否具有血清活性。本专利技术的第五方面在于提供所述的疫苗在制备预防和治疗禽流感和马立克氏病的药物中的应用。该应用可以通过接种马立克氏病疫苗的任何已知方法来给鸡施用二价重组HVT疫苗。例如，用含有缓冲组分、糖类和染料本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗rHVT‑HA，其中，所述HVT重组有禽流感病毒的HA基因，所述HA基因能表达HA蛋白，所述禽流感病毒的HA基因重组到HVT基因组中非必需区US2基因157‑167位氨基酸之间。

【技术特征摘要】
1.一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗rHVT-HA，其中，所述HVT重组有禽流感病毒的HA基因，所述HA基因能表达HA蛋白，所述禽流感病毒的HA基因重组到HVT基因组中非必需区US2基因157-167位氨基酸之间。2.根据权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA，其中，所述HVT为FC126株、PB-THV1株、H-2株、YT-7株、WTHV-1株和HPRS-26株。3.根据权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA，其中，所述HA基因包括禽流感病毒H9亚型的HA基因。4.根据权利要求3所述的活疫苗rHVT-HA，其中，所述HA基因包括H9亚型禽流感病毒HL株、SZ株及A155-1-2014株的HA基因；最优选地，所述HA基因序列包括编码SEO.No.4氨基酸序列的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA，其中，所述二...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，郭丽霞，田克恭，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41