一种绣球菌抗肿瘤免疫活性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种绣球菌抗肿瘤免疫活性检测方法，用于标示和区分绣球菌产品，使其生物活性直观通俗地表达出来，便于人们选用此类产品。本发明专利技术检测方法通过用绣球菌刺激单核细胞株THP-1细胞后所产生细胞因子INF-γ的表达量，与ConA诱导产生的INF-γ的表达量比较，用相应ConA的浓度评价绣球菌的生物活性，标示为ACIF值，直观标示绣球菌产品的生物活性。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术属于生物检测
，具体涉及，用于标示绣球菌的抗肿瘤免疫活性。
技术介绍
:本专利技术主要针对绣球菌进行抗肿瘤免疫活性的检测和标示，同时适用于其他食用菌或药用菌的抗肿瘤免疫活性的检测和标示。绣球菌是药食两用大型真菌，生活条件苛刻，资源蕴藏量比较稀少，是一种非常珍稀名贵的食用菌，在食用菌中仅次于冬虫夏草、羊肚菌、块菌等珍品。因野生绣球菌稀少，而人工培养难度大，因此有“梦幻之菇”之称。直至近几年才实现绣球菌的人工栽培。绣球菌营养丰富，含多种维生素、氨基酸等成分，最突出的特点是葡聚糖含量高，其葡聚糖含量是菇类之最。已有实验表明，绣球菌葡聚糖含量占绣球菌干重的40%以上，是灵芝、姬松茸葡聚糖含量的数倍，其中P -1, 3-D葡聚糖含量占葡聚糖总量的70%左右，而大多具有抗肿瘤活性的多糖都是带有1，6分支的P -1, 3-D葡聚糖。专家们通过X-射线绕射分析得知，^ -1, 3-D-glucan呈现的独特螺旋结构及侧链上的多肽、脂类基团是发挥抗肿瘤功能的重要成因，其分子结构含有蛋白组分，属于绣球菌葡聚糖蛋白复合体(Sparassiscrispa(ffulf.)Fr.Glucan Protein, SGP)。研究发现，与多数食用菌多糖一样，SGP具有抗肿瘤活性，且该活性较其他多糖活性高。临床试验已经证实SGP对于肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症有很好的抑制效果。SGP不仅有抗肿瘤活性，而且可以提高机体造血功能。目前，关于绣球菌的研究多集中在培养条件的优化、绣球菌葡聚糖的提取工艺、绣球菌葡聚糖及其他成分的活性研究，但对于绣球菌的活性检测方法尚未见报道。随着生活质量的提高，食品及保健品行业的迅速发展，绣球菌也将应用到各领域中。因此，建立一种绣球菌的活性检测方法，并且用通俗易懂的方式直观地表示出来，对于绣球菌类产品的推广应用具有深远意义。所述绣球菌的活性检测方法也适用于其它食用菌或药用菌的抗肿瘤免疫活性检测
技术实现思路
:针对绣球菌现有研究，本专利技术的目的在于设计提供一种绣球菌抗肿瘤免疫活性检测方法的技术方案，用于标示和区分绣球菌产品，使其生物活性直观通俗地表达出来，便于人们选用此类产品。科学家们研究发现，SGP对肿瘤、糖尿病、心血管疾病等有惊人的效果，被誉为“免疫黄金”。SGP经过化学方法处理后其生物学功能消失殆尽，原因在于破坏了 SGP的螺旋结构、分支及侧链上的活性基团。由此可知，SGP的生物活性与葡聚糖的分子量、分子构型、支链结构有关。 由于绣球菌生物活性成分SGP，结构复杂，纯化困难，过度纯化的SGP，天然结构被破坏，从而失去其固有的生物活性。纯化的SGP，葡聚糖含量高，而没有天然生物活性，因而检测绣球菌产品的葡聚糖含量，对评价绣球菌产品的生物活性意义不大，开发一种能标示绣球菌生物活性的检测方法，直接检测绣球菌产品的生物活性，非常有必要。SGP的抗肿瘤免疫活性可用抗肿瘤免疫活性因子水平(Anticancer ImmuneFactor, ACIF)标示。SGP具有抗肿瘤免疫活性，但其提高机体的免疫调节能力并非直接作用于肿瘤细胞和病原微生物，而是通过刺激、激活免疫细胞释放细胞因子发挥作用。IFN-Y是由活性淋巴细胞产生的，具有抗病毒、抗肿瘤活性，参与免疫调节。因此，IFN-Y浓度的高低可作为机体免疫调节能力的一种评价指标。刀豆素A (ConA)，是一种植物凝集素，可以诱导细胞产生IFN-Y等细胞因子。本专利技术采用单核细胞株THP-1细胞，通过该细胞经绣球菌刺激后所产生细胞因子INF- y的表达量，与ConA诱导产生的INF- y的表达量比较，用相应ConA的浓度评价绣球菌的生物活性，标示为ACIF值,直观标示绣球菌产品的生物活性。本专利技术的有益效果是:实现了绣球菌抗肿瘤免疫活性的高通量检测，直观标示绣球菌产品的抗肿瘤免疫活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本专利技术为定量测定食用菌或药用菌生物活性提供了基础。，其特征在于包括以下工艺步骤:I)取绣球菌葡聚糖蛋白复合体(SGP)样品，配制成溶液；2)取THP-1细胞，调整细胞密度至IO5 IO6个/ml ；3)向步骤2)中培养得到的细胞中加入步骤I)的SGP溶液至终浓度达到IOii g 2.0mg/ml,然后进行培养；4)取步骤3)得到的培养物离心后收集细胞上清液；5)取步骤4)得到的细胞上清液用ELASA法检测IFN- Y浓度，在SGP作用浓度为IOiig 2.0mg/ml范围内，IFN-y浓度与SGP浓度具有明显的正相关。6)取ConA，按上述步骤检测IFN- y浓度，控制ConA终浓度为1_3 u g/ml，用ConA浓度值的10倍,作为抗肿瘤免疫活性因子水平(Anticancer Immune Factor, ACIF)值。在一个实施方式中，所述的，包括以下工艺步骤:I)取SGP样品，用RPMI1640培养基配制成溶液；2)取THP-1细胞，用RPMI1640培养基调整细胞密度至IO5 IO6个/ml，在37°C下培养24h ；3)向步骤2)培养的细胞中加入步骤I)的SGP溶液并使SGP终浓度达到10 y g 2.0mg/ml，然后置于37°C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养24 48h ；4)取步骤3)得到的培养物以IOOOg离心20min后收集细胞上清液；5)取步骤4)得到的细胞上清液用ELASA法检测IFN- Y浓度，即用人IFN- y酶联免疫分析试剂盒检测IFN-Y浓度:(人IFN-Y酶联免疫分析试剂盒为现有产品)。在SGP作用浓度为10 ii g 2.0mg/ml范围内，IFN- y浓度与SGP具有明显的正相关。6)取ConA，按上述步骤检测IFN- y浓度，控制ConA终浓度为1_3 U g/ml，用ConA浓度值的10倍，作为ACIF值。本专利技术的检测方法也适用于其它食用菌或药用菌的抗肿瘤免疫活性检测。所述食用菌或药用菌还包括灰树花、香菇、冬虫夏草等。附图说明图1为绣球菌葡聚糖蛋白复合体生物活性检测图；图2为灰树花多糖生物活性检测图；图3为香菇多糖生物活性检测图；图4为虫草多糖生物活性检测图。图中:** 表示 P<0.05, *** 表示 P〈0.01。具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例1:绣球菌葡聚糖蛋白复合体(SGP)生物活性检测用RPMI1640培养基配制lmg/ml的SGP溶液；用RPMI1640培养基将THP-1细胞密度调整至IO5-1O6个/ml ；将调整好密度的细胞置于细胞培养碟中，在37°C下培养24h ；培养碟中加入适量lmg/ml SGP溶液，至SGP溶液终浓度分别为0 y g/ml、10 u g/ml、100 u g/ml>200u g/ml ；37 °C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养48h ；以IOOOg离心20min收集细胞上清液；用ELASA法检测IFN- Y浓度，即用人IFN- y酶联免疫分析试剂盒检测IFN- y浓度:(人IFN-Y酶联免疫分析试剂盒为现有产品)标准品及待测样本分别取100 U I加入到酶标板孔中，做好标记；分别向孔中加50 ill酶联亲和物，充分混匀，避免产生气泡；酶标板覆膜于37°C孵育反应60min，充分弃尽孔内液体并扣干孔内剩余残液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绣球菌抗肿瘤免疫活性的检测方法,其特征在于包括以下工艺步骤：1）取绣球菌葡聚糖蛋白复合体（SGP）样品，配制成溶液；2）取THP?1细胞，调整细胞密度至105～106个/ml；3）向步骤2）中培养得到的细胞中加入步骤1）的SGP溶液至终浓度达到10μg～2.0mg/ml，然后进行培养；4）取步骤3）得到的培养物离心后收集细胞上清液；5）取步骤4）得到的细胞上清液用ELASA法检测IFN?γ浓度，在SGP作用浓度为10μg～2.0mg/ml范围内，IFN?γ浓度与SGP浓度具有明显的正相关。6）取ConA，按上述步骤检测IFN?γ浓度，控制ConA终浓度为1?3μg/ml，用ConA浓度值的10倍，作为抗肿瘤免疫活性因子水平（Anticancer?Immune?Factor，ACIF）值。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕正兵，董淮海，叶甫云，
申请(专利权)人：上海科爱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：